本文關(guān)鍵詞：弓形蟲表面抗原IMP1的克隆原核表達(dá)及免疫學(xué)鑒定

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【摘要】：目的克隆剛地弓形蟲強(qiáng)毒RH株的表面抗原免疫作圖蛋白1(Immune mapped protein-1,IMP1),并對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)純化、鑒定。方法采用逆轉(zhuǎn)錄法合成剛地弓形蟲RH株的第一鏈c DNA,以此為模板,用PCR法擴(kuò)增野生型IMP1基因的最大開(kāi)放閱讀框(ORF)序列,TA克隆測(cè)序鑒定后,插入原核表達(dá)載體p ET28b中,構(gòu)建重組表達(dá)載體p ET28bIMP1,經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3),經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)攜帶6×組氨酸標(biāo)簽的IMP1融合蛋白,改變溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度以優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件并測(cè)定蛋白可溶性,通過(guò)鎳離子螯合(Ni2+-NTA)親和層析純化IMP1融合蛋白,經(jīng)Western blotting驗(yàn)證重組蛋白的特異性。結(jié)果在弓形蟲RH株速殖子c DNA中成功調(diào)取了IMP1基因的ORF序列,并通過(guò)TA克隆和測(cè)序鑒定了IMP1基因的正確性,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒p ET28b-IMP1,經(jīng)雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證了重組載體的正確性,并通過(guò)條件篩選確定了IMP1的最佳表達(dá)條件為20℃下0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)9 h。經(jīng)鎳柱親和層析純化后,IMP1全蛋白表達(dá)量和可溶性均較好,與鎳柱填料有較高的親和力,能實(shí)現(xiàn)高效純化。經(jīng)SDS-PAGE及Western blotting鑒定,IMP1具有良好的免疫活性。結(jié)論新型強(qiáng)毒弓形蟲RH株的表面抗原IMP1可在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá),全長(zhǎng)蛋白可溶,性狀穩(wěn)定。本研究為進(jìn)一步制備IMP1多克隆抗體,進(jìn)行后續(xù)的體內(nèi)表達(dá)研究以及抗弓形蟲感染亞單位疫苗的構(gòu)建和IMP1晶體結(jié)構(gòu)研究奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 山東省寄生蟲病防治研究所;
【關(guān)鍵詞】： 弓形蟲 免疫作圖蛋白基因 表面抗原 原核表達(dá) 純化
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(31300617) 山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金(BS2013SW015) 山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(WSO370)
【分類號(hào)】：R382.5
【正文快照】： 弓形蟲為機(jī)會(huì)致病原蟲,其宿主范圍廣泛,感染后對(duì)免疫缺陷人群、孕產(chǎn)婦及家畜可造成嚴(yán)重后果,且至今無(wú)有效防治措施[1-2]。弓形蟲病為人畜共患寄生蟲病,其治療無(wú)特效藥,以化學(xué)藥物為主。目前臨床上使用的藥物包括磺胺嘧啶、乙胺嘧啶、阿奇霉素、青蒿素等均存在毒副作用大、具有

【共引文獻(xiàn)】

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【相似文獻(xiàn)】

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