本文關(guān)鍵詞：miR-29a靶向調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞HMGN3基因表達(dá)研究

  更多相關(guān)文章： 間充質(zhì)干細(xì)胞 神經(jīng)分化 microRNA HGN3 MYCN

【摘要】：MiRNA是一種大小約21-23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA,定位于RNA前體的3’端或者5’端,參與調(diào)控基因表達(dá),從而廣泛地參與細(xì)胞生物學(xué)過程,包括發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)體外增殖和分化均受miRNAs調(diào)控。MSCs是來源于中胚層的成體干細(xì)胞,廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中,以骨髓組織中含量最為豐富。MSCs具有高度增殖、自我更新和多向分化潛能。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-29a/b參與體外MSCs向神經(jīng)細(xì)胞的分化調(diào)控,同時(shí)通過生物信息學(xué)分析,預(yù)測與細(xì)胞周期調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的MYCN、HMGN3、MAFB和PTP4A1是miR-29的靶基因。 本文通過在MSCs中高表達(dá)miR-29a,檢測PTP4A1、HMGN3、MAFB和MYCN的表達(dá)改變,進(jìn)一步利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-29a與靶基因的直接靶向作用,并進(jìn)一步證明miR-29a可通過靶向上述基因從而參與MSCs向神經(jīng)細(xì)胞的分化調(diào)控。目的 研究miR-29a對骨髓MSCs的神經(jīng)分化和增殖調(diào)控的靶基因。 方法 1.大鼠骨髓MSCs的體外分離和培養(yǎng)。分離SD大鼠雙側(cè)股骨和脛骨骨髓,培養(yǎng)大鼠的MSCs至第三代。 2.慢病毒介導(dǎo)miR-29a前體在MSCs中表達(dá)。 3.實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)檢測MYCN、HMGN3、PTP4A1和MYAB基因表達(dá)的mRNA表達(dá)。 4.免疫印跡法(western blot, WB)檢測HMGN3的蛋白表達(dá)。 5.雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-29a靶向HMGN3。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)值用樣本均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間差異,以Q=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果 1.體外分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增骨髓MSCs 體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs,采用反復(fù)貼壁純化方法,當(dāng)傳至第三代時(shí),細(xì)胞純化超過99%,滿足實(shí)驗(yàn)要求。 2.慢病毒介導(dǎo)miR-29a在MSCs中高表達(dá) 用制備好的病毒上清感染P3MSCs,4d后EGFP熒光到達(dá)高峰,MSCs細(xì)胞維持梭形、克隆樣增生。miR-29a表達(dá)量在miR-29a感染組中顯著增高(4倍)。 3. miR-29a高表達(dá)抑制IYCN和HMGN3在MSCs中的表達(dá) 檢測miR-29a預(yù)測靶基因MYCN、HMGN3、PTP4A1和MYAB的mRNA表達(dá),結(jié)果顯示在四種基因中,MYCN和HMGN3的表達(dá)在miR-29a高表達(dá)的MSCs中顯著降低。免疫印跡法顯示HMGN3蛋白表達(dá)同時(shí)降低。 4. miR-29a直接靶向HMGN3 利用pmirGLO載體多克隆位點(diǎn),成功將HMGN33' UTR基因結(jié)合區(qū)克隆到Nhe1和Sal1酶切位點(diǎn)。 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將HMGN3-pmirGLO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入PC12細(xì)胞,48h后再用慢病毒介導(dǎo)miR-29a前體在PC12細(xì)胞中高表達(dá),感染48h后80%以上PC12細(xì)胞被成功感染并顯示EGFP綠色熒光,qRT-PCR檢測miR-29a表達(dá)增高約5倍。 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示miR-29a可顯著降低熒光素酶顯色,證明miR-29a可直接靶向HMGN33'UTR區(qū)并抑制其表達(dá)。結(jié)論 miR-29a靶向并抑制HMGN3在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá),提示其可能參與MSCs向神經(jīng)細(xì)胞的分化調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細(xì)胞 神經(jīng)分化 microRNA HGN3 MYCN
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 目錄10-11
• 英文縮略詞表11-12
• 前言12-14
• 材料和方法14-22
• 結(jié)果22-27
• 討論27-29
• 結(jié)論29-30
• 參考文獻(xiàn)30-33
• 綜述 miRNA在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)性疾病中的作用33-47
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 個(gè)人簡介47
• 在學(xué)期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文47-48
• 致謝48

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 程琦;miR-29a靶向調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞HMGN3基因表達(dá)研究[D];鄭州大學(xué);2013年

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本文編號：836082