本文關(guān)鍵詞：葉酸受體αDNA疫苗的構(gòu)建及免疫活性的初步研究

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【摘要】：目的:葉酸受體α(FRα)為一種分子量為38KD細(xì)胞膜糖蛋白,通過(guò)糖基磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞膜上。研究表明,FRα在正常組織中分布極少,而在卵巢腫瘤細(xì)胞表面有大量表達(dá)。因此,被認(rèn)為是一種極具潛力的卵巢癌相關(guān)抗原。本研究利用FRα的腫瘤抗原特異性,構(gòu)建FRα-pc DNA3.1 DNA疫苗,檢測(cè)其誘導(dǎo)FRα特異性免疫反應(yīng)能力,為開(kāi)發(fā)卵巢癌治療藥物奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法:本實(shí)驗(yàn)從高表達(dá)葉酸受體α的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中提取總RNA,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到含有FRα基因的c DNA,根據(jù)已報(bào)道FRα基因序列設(shè)計(jì)特異性引物PCR擴(kuò)增FRα基因片段,并在起始密碼ATG處加上Konzak序列。目的基因使用HindⅢ和Eco RⅠ雙酶切后酶連到真核細(xì)胞表達(dá)載體pc DNA3.1中以獲得新構(gòu)建的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染入人胚腎細(xì)胞HEK293中,從而獲得含有目的基因的工程菌株。利用RT-PCR、Western blot及細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)FRα的表達(dá)。FRα作為核酸疫苗免疫BALB/c小鼠,通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)、淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性殺傷實(shí)驗(yàn)研究該疫苗激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)及體液免疫反應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)果:通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到750bp左右的FRα基因片段,并構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒,經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定正確。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞72h后,RT-PCR檢測(cè)到細(xì)胞中FRαm RNA的存在,Western blot、細(xì)胞免疫熒光證明FRα蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。重組質(zhì)粒免疫小鼠后,ELISA檢測(cè)血清中抗FRα抗體滴度明顯上升,小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖明顯,但FRα特異性CTL反應(yīng)不明顯。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了FRα-pcDNA3.1 DNA疫苗,并建立了疫苗活性研究方法,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該疫苗具有一定的抗腫瘤活性,為開(kāi)發(fā)卵巢癌治療藥物奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：卵巢癌 葉酸受體α 真核表達(dá) DNA疫苗
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• ABBREVIATION6-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 前言11-15
• 1 卵巢癌11
• 2 葉酸受體 α11-12
• 3 基于葉酸受體 α 的卵巢癌基因免疫治療12-13
• 4 CpG ODN佐劑13
• 5 本文研究思路及技術(shù)路線圖13-15
• 第一章 FRα真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建15-35
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器15-19
• 1.1.1 菌種與質(zhì)粒15
• 1.1.2 細(xì)胞株15-16
• 1.1.3 試劑16-17
• 1.1.4 培養(yǎng)基/緩沖液配制17-18
• 1.1.5 儀器18-19
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法19-29
• 1.2.1 FRα cDNA的制備19-21
• 1.2.2 FRα- pcDNA3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建21-26
• 1.2.4 重組質(zhì)粒鑒定26-27
• 1.2.5 重組質(zhì)粒的大量制備以及測(cè)定27-29
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-33
• 1.3.1 FRα cDNA的制備29-30
• 1.3.2 FRα-pcDNA3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建30-33
• 1.4 討論33-34
• 1.5 本章小結(jié)34-35
• 第二章 FRα 在HEK293細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)以及鑒定35-46
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器35-37
• 2.1.1 細(xì)胞株35
• 2.1.2 試劑35-36
• 2.1.3 培養(yǎng)基/緩沖液配方36-37
• 2.1.4 儀器37
• 2.2 脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞37-38
• 2.2.1 HEK293細(xì)胞鋪板37-38
• 2.2.2 轉(zhuǎn)染樣品的準(zhǔn)備38
• 2.3 FRα 表達(dá)鑒定38-42
• 2.3.1 Western blot鑒定38-40
• 2.3.2 細(xì)胞免疫熒光鑒定40
• 2.3.3 RT-PCR鑒定40-42
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-44
• 2.4.1 Western blot鑒定42-43
• 2.4.2 細(xì)胞免疫熒光43-44
• 2.4.3 RT-PCR鑒定44
• 2.5 討論44-45
• 2.6 本章小結(jié)45-46
• 第三章 葉酸受體α核酸疫苗活性研究46-60
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器46-47
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物46
• 3.1.2 試劑46-47
• 3.1.3 培養(yǎng)基/緩沖液配方47
• 3.1.4 儀器47
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法47-51
• 3.2.1 DNA疫苗免疫47-48
• 3.2.2 小鼠血清抗體滴度檢測(cè)48-49
• 3.2.3 小鼠脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)49-50
• 3.2.4 CTL特異性殺傷實(shí)驗(yàn)50-51
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-57
• 3.3.1 血清中抗體滴度檢測(cè)51-54
• 3.3.2 小鼠脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)54-56
• 3.3.3 CTL實(shí)驗(yàn)56-57
• 3.4 討論57-59
• 3.5 本章小結(jié)59-60
• 本文總結(jié)60-61
• 參考文獻(xiàn)61-63
• 綜述63-72
• 參考文獻(xiàn)69-72
• 附錄1 pMD-18T質(zhì)粒圖譜及 pc DNA3.1(+) 質(zhì)粒圖譜72-73
• 附錄2 FRα-pc DNA3.1測(cè)序結(jié)果73-74
• 附錄3 碩士階段已發(fā)表文章74-75
• 致謝75

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