本文關鍵詞：葉酸受體αDNA疫苗的構建及免疫活性的初步研究

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【摘要】：目的:葉酸受體α(FRα)為一種分子量為38KD細胞膜糖蛋白,通過糖基磷脂酰肌醇錨定在細胞膜上。研究表明,FRα在正常組織中分布極少,而在卵巢腫瘤細胞表面有大量表達。因此,被認為是一種極具潛力的卵巢癌相關抗原。本研究利用FRα的腫瘤抗原特異性,構建FRα-pc DNA3.1 DNA疫苗,檢測其誘導FRα特異性免疫反應能力,為開發(fā)卵巢癌治療藥物奠定基礎。實驗方法:本實驗從高表達葉酸受體α的卵巢癌細胞株SKOV3中提取總RNA,通過逆轉錄得到含有FRα基因的c DNA,根據已報道FRα基因序列設計特異性引物PCR擴增FRα基因片段,并在起始密碼ATG處加上Konzak序列。目的基因使用HindⅢ和Eco RⅠ雙酶切后酶連到真核細胞表達載體pc DNA3.1中以獲得新構建的重組質粒。將重組質粒通過脂質體介導法轉染入人胚腎細胞HEK293中,從而獲得含有目的基因的工程菌株。利用RT-PCR、Western blot及細胞免疫熒光染色檢測細胞內FRα的表達。FRα作為核酸疫苗免疫BALB/c小鼠,通過ELISA實驗、淋巴細胞增殖實驗和細胞毒性殺傷實驗研究該疫苗激發(fā)細胞免疫反應及體液免疫反應強度。結果:通過RT-PCR擴增得到750bp左右的FRα基因片段,并構建了真核表達重組質粒,經酶切、測序鑒定正確。轉染HEK293細胞72h后,RT-PCR檢測到細胞中FRαm RNA的存在,Western blot、細胞免疫熒光證明FRα蛋白在細胞中的表達。重組質粒免疫小鼠后,ELISA檢測血清中抗FRα抗體滴度明顯上升,小鼠脾淋巴細胞體外增殖明顯,但FRα特異性CTL反應不明顯。結論:本實驗成功構建了FRα-pcDNA3.1 DNA疫苗,并建立了疫苗活性研究方法,實驗結果顯示該疫苗具有一定的抗腫瘤活性,為開發(fā)卵巢癌治療藥物奠定基礎。
【關鍵詞】：卵巢癌 葉酸受體α 真核表達 DNA疫苗
【學位授予單位】：中國藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• ABBREVIATION6-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 前言11-15
• 1 卵巢癌11
• 2 葉酸受體 α11-12
• 3 基于葉酸受體 α 的卵巢癌基因免疫治療12-13
• 4 CpG ODN佐劑13
• 5 本文研究思路及技術路線圖13-15
• 第一章 FRα真核表達重組質粒的構建15-35
• 1.1 實驗材料和儀器15-19
• 1.1.1 菌種與質粒15
• 1.1.2 細胞株15-16
• 1.1.3 試劑16-17
• 1.1.4 培養(yǎng)基/緩沖液配制17-18
• 1.1.5 儀器18-19
• 1.2 實驗方法19-29
• 1.2.1 FRα cDNA的制備19-21
• 1.2.2 FRα- pcDNA3.1 重組質粒的構建21-26
• 1.2.4 重組質粒鑒定26-27
• 1.2.5 重組質粒的大量制備以及測定27-29
• 1.3 實驗結果29-33
• 1.3.1 FRα cDNA的制備29-30
• 1.3.2 FRα-pcDNA3.1 重組質粒的構建30-33
• 1.4 討論33-34
• 1.5 本章小結34-35
• 第二章 FRα 在HEK293細胞中的瞬時表達以及鑒定35-46
• 2.1 實驗材料和儀器35-37
• 2.1.1 細胞株35
• 2.1.2 試劑35-36
• 2.1.3 培養(yǎng)基/緩沖液配方36-37
• 2.1.4 儀器37
• 2.2 脂質體法瞬時轉染HEK293細胞37-38
• 2.2.1 HEK293細胞鋪板37-38
• 2.2.2 轉染樣品的準備38
• 2.3 FRα 表達鑒定38-42
• 2.3.1 Western blot鑒定38-40
• 2.3.2 細胞免疫熒光鑒定40
• 2.3.3 RT-PCR鑒定40-42
• 2.4 實驗結果42-44
• 2.4.1 Western blot鑒定42-43
• 2.4.2 細胞免疫熒光43-44
• 2.4.3 RT-PCR鑒定44
• 2.5 討論44-45
• 2.6 本章小結45-46
• 第三章 葉酸受體α核酸疫苗活性研究46-60
• 3.1 實驗材料及儀器46-47
• 3.1.1 實驗動物46
• 3.1.2 試劑46-47
• 3.1.3 培養(yǎng)基/緩沖液配方47
• 3.1.4 儀器47
• 3.2 實驗方法47-51
• 3.2.1 DNA疫苗免疫47-48
• 3.2.2 小鼠血清抗體滴度檢測48-49
• 3.2.3 小鼠脾細胞增殖實驗49-50
• 3.2.4 CTL特異性殺傷實驗50-51
• 3.3 實驗結果51-57
• 3.3.1 血清中抗體滴度檢測51-54
• 3.3.2 小鼠脾細胞增殖實驗54-56
• 3.3.3 CTL實驗56-57
• 3.4 討論57-59
• 3.5 本章小結59-60
• 本文總結60-61
• 參考文獻61-63
• 綜述63-72
• 參考文獻69-72
• 附錄1 pMD-18T質粒圖譜及 pc DNA3.1(+) 質粒圖譜72-73
• 附錄2 FRα-pc DNA3.1測序結果73-74
• 附錄3 碩士階段已發(fā)表文章74-75
• 致謝75

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