本文關鍵詞：小凹蛋白-1對毒胡蘿卜素誘導的RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡途徑機制的研究

  更多相關文章： 小凹蛋白-1 Bcl-2 Bcl-xl 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 凋亡 巨噬細胞 動脈粥樣硬化

【摘要】：目的 本研究通過觀察小凹蛋白-1(caveolin-1, Cav-1)對毒胡蘿卜素(thapsigargin, TG)誘導的RAW264.7細胞凋亡以及凋亡相關蛋白Bcl-2和Bcl-xl表達的調(diào)節(jié)作用，探討Cav-1與細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡途徑的相互作用，并進一步探討凋亡相關蛋白的作用及其分子機制，為Cav-1抗動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)的機制研究提供新的干預靶點。 方法 1.巨噬細胞RAW264.7內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型的建立：分別以0.3、1、3μmol/L三個濃度的TG與RAW264.7細胞共同培養(yǎng)，于12、24、36、48h四個時間點檢測細胞存活率，以存活率50%作為巨噬細胞凋亡的標志，選擇經(jīng)TG誘導制備RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型的適宜時間和濃度。 2.siRNA技術沉默細胞Cav-1表達：用脂質(zhì)體導入法將cav-1siRNA導入RAW264.7細胞，孵育48-96h后采用western blot法檢測Cav-1的表達，篩選Cav-1蛋白表達下降75%以上的細胞作為成功轉染的細胞（稱作Cav-1-siRNA），并確定最佳轉染條件。 3.檢測Cav-1對RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡的影響：實驗分為正常對照組、模型組、 Cav-1siRNA組、 Cav-1siRNAsiRNA+TG組。 AnnexinV-FITC/PI雙染法在流式細胞儀(flow cytometry, FCM)上檢測各組細胞凋亡率； 4.檢測Cav-1對RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關基因Bcl-2和Bcl-xl的mRNA含量的影響：沉默細胞Cav-1基因表達，采用半定量PCR法檢測各組細胞中Bcl-2和Bcl-xl的mRNA變化,分析Cav-1是否影響RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應中Bcl-2、Bcl-xl基因的mRNA水平。 5.檢測Cav-1對RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白Bcl-2和Bcl-xl的蛋白表達的影響：RAW264.7細胞中Cav-1被沉默前后，采用免疫印跡法(western blotting)檢測各組細胞中Bcl-2和Bcl-xl蛋白表達水平的變化，繼續(xù)探討Cav-1對RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應中Bcl-2、Bcl-xl蛋白表達的調(diào)節(jié)作用。 結果 1.巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型的建立：1μmol/L的TG與RAW264.7細胞共同培養(yǎng)24h，細胞存活率為42.07±3.35%，根據(jù)存活率50%作為細胞凋亡的標志，此時細胞已轉變?yōu)榈蛲黾毎�。因此，選擇1μmol/L的TG作用RAW264.7細胞24h建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡細胞模型，進行后續(xù)實驗。 2. siRNA技術沉默細胞Cav-1表達效果：將siRNA導入RAW264.7細胞孵育48h后采用western blot法檢測Cav-1的表達,與正常組及陰性對照組相比均下降80%，將成功轉染的細胞進行后續(xù)實驗。 3. Cav-1對RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡的影響：抑制了RAW264.7細胞Cav-1表達后，cav-1-siRNA能夠促進TG誘導的RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激損傷，與TG組相比，細胞凋亡率升高(P0.05)。 4. Cav-1對RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡基因Bcl-2及Bcl-xl mRNA的影響：半定量PCR結果顯示，，Cav-1被沉默后可明顯下調(diào)TG誘導的RAW264.7細胞凋亡基因Bcl-2及Bcl-xl的mRNA含量，且比較結果有顯著性差異(P0.05)。 5. Cav-1對RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xl蛋白表達的影響：western blotting檢測Bcl-2及Bcl-xl的蛋白表達，結果顯示沉默RAW264.7細胞Cav-1的表達后，Bcl-2及Bcl-xl的蛋白表達較對照組明顯下降(P0.05)。 結論 1.Cav-1基因沉默后可增加TG誘導的RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡損傷，由此得出TG誘導的RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡中Cav-1對其具有抑制作用； 2.Cav-1在TG誘導的RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過程中可增加Bcl-2和Bcl-xl的表達，由此表明Cav-1對RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡途徑的抑制作用與Bcl-2和Bcl-xl信號通路有關。
【關鍵詞】：小凹蛋白-1 Bcl-2 Bcl-xl 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 凋亡 巨噬細胞 動脈粥樣硬化
【學位授予單位】：泰山醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 符號說明10-11
• 前言11-16
• 材料與方法16-36
• 結果36-38
• 討論38-43
• 結論43-44
• 附表44-47
• 參考文獻47-53
• 綜述53-60
• 參考文獻57-60
• 致謝60-61
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文61

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 丁培杰;楊書欽;曹明瑞;臧文巧;陳宗德;趙國強;;人血管內(nèi)皮生長因子mRNA靶向siRNA表達載體的構建和表達[J];鄭州大學學報(醫(yī)學版);2007年02期

2 覃麗;秦旭平;王佐;朱炳陽;廖端芳;;普伐他汀對泡沫細胞內(nèi)膽固醇酯的影響及與小凹蛋白-1的關系[J];生理學報;2006年01期

本文編號：826214