本文關(guān)鍵詞：小凹蛋白-1對毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： 小凹蛋白-1 Bcl-2 Bcl-xl 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 凋亡 巨噬細(xì)胞 動脈粥樣硬化

【摘要】：目的 本研究通過觀察小凹蛋白-1(caveolin-1, Cav-1)對毒胡蘿卜素(thapsigargin, TG)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞凋亡以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bcl-xl表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，探討Cav-1與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑的相互作用，并進(jìn)一步探討凋亡相關(guān)蛋白的作用及其分子機(jī)制，為Cav-1抗動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)的機(jī)制研究提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。 方法 1.巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型的建立：分別以0.3、1、3μmol/L三個濃度的TG與RAW264.7細(xì)胞共同培養(yǎng)，于12、24、36、48h四個時間點(diǎn)檢測細(xì)胞存活率，以存活率50%作為巨噬細(xì)胞凋亡的標(biāo)志，選擇經(jīng)TG誘導(dǎo)制備RAW264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型的適宜時間和濃度。 2.siRNA技術(shù)沉默細(xì)胞Cav-1表達(dá)：用脂質(zhì)體導(dǎo)入法將cav-1siRNA導(dǎo)入RAW264.7細(xì)胞，孵育48-96h后采用western blot法檢測Cav-1的表達(dá)，篩選Cav-1蛋白表達(dá)下降75%以上的細(xì)胞作為成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（稱作Cav-1-siRNA），并確定最佳轉(zhuǎn)染條件。 3.檢測Cav-1對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的影響：實驗分為正常對照組、模型組、 Cav-1siRNA組、 Cav-1siRNAsiRNA+TG組。 AnnexinV-FITC/PI雙染法在流式細(xì)胞儀(flow cytometry, FCM)上檢測各組細(xì)胞凋亡率； 4.檢測Cav-1對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因Bcl-2和Bcl-xl的mRNA含量的影響：沉默細(xì)胞Cav-1基因表達(dá)，采用半定量PCR法檢測各組細(xì)胞中Bcl-2和Bcl-xl的mRNA變化,分析Cav-1是否影響RAW264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中Bcl-2、Bcl-xl基因的mRNA水平。 5.檢測Cav-1對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Bcl-2和Bcl-xl的蛋白表達(dá)的影響：RAW264.7細(xì)胞中Cav-1被沉默前后，采用免疫印跡法(western blotting)檢測各組細(xì)胞中Bcl-2和Bcl-xl蛋白表達(dá)水平的變化，繼續(xù)探討Cav-1對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中Bcl-2、Bcl-xl蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。 結(jié)果 1.巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型的建立：1μmol/L的TG與RAW264.7細(xì)胞共同培養(yǎng)24h，細(xì)胞存活率為42.07±3.35%，根據(jù)存活率50%作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志，此時細(xì)胞已轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛲黾?xì)胞。因此，選擇1μmol/L的TG作用RAW264.7細(xì)胞24h建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡細(xì)胞模型，進(jìn)行后續(xù)實驗。 2. siRNA技術(shù)沉默細(xì)胞Cav-1表達(dá)效果：將siRNA導(dǎo)入RAW264.7細(xì)胞孵育48h后采用western blot法檢測Cav-1的表達(dá),與正常組及陰性對照組相比均下降80%，將成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。 3. Cav-1對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的影響：抑制了RAW264.7細(xì)胞Cav-1表達(dá)后，cav-1-siRNA能夠促進(jìn)TG誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷，與TG組相比，細(xì)胞凋亡率升高(P0.05)。 4. Cav-1對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡基因Bcl-2及Bcl-xl mRNA的影響：半定量PCR結(jié)果顯示，，Cav-1被沉默后可明顯下調(diào)TG誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞凋亡基因Bcl-2及Bcl-xl的mRNA含量，且比較結(jié)果有顯著性差異(P0.05)。 5. Cav-1對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xl蛋白表達(dá)的影響：western blotting檢測Bcl-2及Bcl-xl的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示沉默RAW264.7細(xì)胞Cav-1的表達(dá)后，Bcl-2及Bcl-xl的蛋白表達(dá)較對照組明顯下降(P0.05)。 結(jié)論 1.Cav-1基因沉默后可增加TG誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡損傷，由此得出TG誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡中Cav-1對其具有抑制作用； 2.Cav-1在TG誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中可增加Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)，由此表明Cav-1對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑的抑制作用與Bcl-2和Bcl-xl信號通路有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：小凹蛋白-1 Bcl-2 Bcl-xl 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 凋亡 巨噬細(xì)胞 動脈粥樣硬化
【學(xué)位授予單位】：泰山醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 符號說明10-11
• 前言11-16
• 材料與方法16-36
• 結(jié)果36-38
• 討論38-43
• 結(jié)論43-44
• 附表44-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 綜述53-60
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 致謝60-61
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文61

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 丁培杰;楊書欽;曹明瑞;臧文巧;陳宗德;趙國強(qiáng);;人血管內(nèi)皮生長因子mRNA靶向siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2007年02期

2 覃麗;秦旭平;王佐;朱炳陽;廖端芳;;普伐他汀對泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的影響及與小凹蛋白-1的關(guān)系[J];生理學(xué)報;2006年01期

本文編號：826214