本文關(guān)鍵詞：諾如病毒多表位抗原基因的表達(dá)及多克隆抗體制備

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【摘要】：諾如病毒是引起人類非細(xì)菌性胃腸炎的主要病原之一，可導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。諾如病毒具有很高的傳染性和變異性，可以使各年齡段的人引發(fā)急性胃腸炎，尤其在抵抗力弱的人群中有很高的發(fā)病率，因此快速、盡早地確診對(duì)預(yù)防和控制諾如病毒的傳播是非常重要的。近年來(lái)對(duì)諾如病毒的研究，多是采用表達(dá)全長(zhǎng)ORF2所編碼的衣殼蛋白，制備單克隆抗體，再通過(guò)ELISA等方法進(jìn)行檢測(cè)，其對(duì)單一基因型諾如病毒的檢測(cè)無(wú)疑是準(zhǔn)確的，卻無(wú)法同時(shí)確定多個(gè)基因型別的樣品，這限制了其在檢測(cè)中的應(yīng)用。多表位抗原基因是運(yùn)用重組DNA技術(shù)將多個(gè)編碼抗原表位的核苷酸片段串連組合起來(lái)構(gòu)成，其在HIV、CSFV和結(jié)核桿菌等方面的研究已經(jīng)取得突破性進(jìn)展，然而目前對(duì)諾如病毒多表位抗原基因的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本論文通過(guò)化學(xué)合成、PCR擴(kuò)增和酶切連接相結(jié)合的方法將4段S區(qū)表位序列進(jìn)行串聯(lián)，，在原核表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)得到重組融合蛋白；用純化得到的重組融合蛋白免疫兔子，獲得兔抗NoV多克隆抗體；利用制備的兔抗NoV多克隆抗體包被磁珠，獲得免疫磁珠，應(yīng)用免疫磁珠對(duì)諾如病毒顆粒進(jìn)行富集研究，得到以下結(jié)果： (1)根據(jù)已經(jīng)發(fā)表文獻(xiàn)中表位信息，選擇諾如病毒衣殼蛋白靠近N端S區(qū)的3個(gè)表位，通過(guò)化學(xué)合成的方法得到NoV多表位抗原基因前段基因片段A；結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期的研究?jī)?nèi)容和NCBI中提供的序列信息，根據(jù)S區(qū)設(shè)計(jì)引物，以編號(hào)1004株諾如病毒cDNA為模板，擴(kuò)增得到NoV多表位抗原基因后段基因片段B；將A和B連接起來(lái)構(gòu)建了諾如病毒多表位抗原基因，核苷酸長(zhǎng)438bp，共編碼145個(gè)氨基酸，并將其與表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)連接，轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）中進(jìn)行原核表達(dá)，得到34kDa的重組融合蛋白。30°C誘導(dǎo)6h后，經(jīng)SDS-PAGE分析，目的蛋白占全菌總蛋白的35%左右，并且大部分為可溶性蛋白，利用親和層析方法純化得到重組融合蛋白。 (2)將純化得到的重組融合蛋白濃縮后加入免疫佐劑免疫兔子，經(jīng)5次免疫后，心臟采血獲得抗血清，用辛酸-硫酸銨鹽析法純化多克隆抗體，間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)為1:51200。 (3)將兔抗NoV多克隆抗體包被磁珠，對(duì)磁珠與抗體偶聯(lián)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的條件為：最佳包被介質(zhì)為PBS，最佳pH為7.4，最佳包被時(shí)間為3h，最佳包被溫度為20°C，最佳抗體濃度為300μg/mL。用制備的免疫磁珠對(duì)肛拭子中諾如病毒進(jìn)行富集研究，提取富集前后的病毒RNA，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)，結(jié)果表明富集后的諾如病毒檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，免疫磁珠對(duì)GI、GII型諾如病毒都有吸附效果，制備的多克隆抗體能很好的與諾如病毒顆粒產(chǎn)生特異性結(jié)合。
【關(guān)鍵詞】：諾如病毒 多表位基因 克隆表達(dá) 抗體制備 免疫磁珠
【學(xué)位授予單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373;R392
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 主要符號(hào)表10-11
• 第1章 引言11-22
• 1.1 諾如病毒基本特征11-13
• 1.1.1 諾如病毒的傳播及流行11-12
• 1.1.2 諾如病毒形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)特征12-13
• 1.1.3 諾如病毒的分型13
• 1.2 諾如病毒檢測(cè)方法研究進(jìn)展13-17
• 1.2.1 RT-PCR 方法14-15
• 1.2.2 免疫學(xué)方法15-16
• 1.2.3 基因芯片技術(shù)16-17
• 1.2.4 展望17
• 1.3 諾如病毒衣殼蛋白的表達(dá)17-18
• 1.3.1 NoV 衣殼蛋白桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)17-18
• 1.3.2 NoV 衣殼蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)18
• 1.4 多表位抗原基因的研究進(jìn)展18-21
• 1.4.1 抗原表位的預(yù)測(cè)18-19
• 1.4.2 多表位抗原基因的設(shè)計(jì)19
• 1.4.3 多表位抗原基因的應(yīng)用19-21
• 1.5 本論文的研究目的與意義21
• 1.6 研究?jī)?nèi)容21-22
• 1.6.1 諾如病毒多表位基因的構(gòu)建及表達(dá)21
• 1.6.2 兔抗 NoV 多克隆抗體的制備21
• 1.6.3 免疫磁珠的初步應(yīng)用21-22
• 第2章 諾如病毒多表位抗原基因的構(gòu)建、表達(dá)及蛋白純化22-45
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-25
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及病毒株22
• 2.1.2 主要試劑22-23
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備23-24
• 2.1.4 主要溶液的配制24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-35
• 2.2.1 NoV 多表位抗原基因前段基因片段 A 的設(shè)計(jì)與合成25
• 2.2.2 NoV 多表位抗原基因后段基因片段 B 的克隆25-28
• 2.2.3 重組質(zhì)粒 pET-novme 的構(gòu)建28-31
• 2.2.4 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化31-33
• 2.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的 Western Blot 分析33
• 2.2.6 Bradford 法測(cè)定蛋白濃度33-34
• 2.2.7 多克隆抗體的制備34
• 2.2.8 兔抗多克隆抗體的純化34-35
• 2.2.9 ELISA 方法測(cè)定抗體效價(jià)35
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-42
• 2.3.1 NoV 多表位抗原基因前段基因片段 A 的合成35-36
• 2.3.2 NoV 多表位抗原基因后段基因片段 B 的擴(kuò)增36-37
• 2.3.3 重組質(zhì)粒 pET-novme 的構(gòu)建及鑒定37-38
• 2.3.4 多表位基因的生物信息學(xué)特征38-40
• 2.3.5 復(fù)合基因的表達(dá)、純化及鑒定40
• 2.3.6 蛋白濃度的測(cè)定40-41
• 2.3.7 抗體純化效果分析41
• 2.3.8 抗體效價(jià)的測(cè)定41-42
• 2.4 分析與討論42-45
• 第3章 免疫磁珠法富集諾如病毒初步研究45-55
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料45-46
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)所用病毒株45
• 3.1.2 主要試劑45-46
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備46
• 3.1.4 主要溶液的配制46
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法46-49
• 3.2.1 兔抗 NoV 多克隆抗體與磁珠偶聯(lián)條件的確定46-47
• 3.2.2 免疫磁珠的封閉與保存47-48
• 3.2.3 免疫磁珠對(duì) NoV 的富集研究48-49
• 3.2.4 免疫磁珠技術(shù)的特異性實(shí)驗(yàn)49
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-54
• 3.3.1 兔抗 NoV 多克隆抗體與磁珠的最佳偶聯(lián)條件49-51
• 3.3.2 免疫磁珠捕獲 NoV 效果分析51-53
• 3.3.3 免疫磁珠的特異性53-54
• 3.4 分析與討論54-55
• 第4章 結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)55-57
• 4.1 本論文的研究總結(jié)55
• 4.2 展望55-56
• 4.3 創(chuàng)新點(diǎn)56-57
• 致謝57-58
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：825984