發(fā)布時(shí)間：2017-09-10 16:47

  本文關(guān)鍵詞：激活的Rap1和H-Ras對(duì)E-Cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附連接的調(diào)節(jié)

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【摘要】：粘附連接是E-cadherin（E-鈣粘蛋白）介導(dǎo)的上皮細(xì)胞間粘附結(jié)構(gòu)，其胞外部分是反式相互作用的E-鈣粘蛋白，胞內(nèi)通過(guò)p120-連環(huán)蛋白(p120-catenin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)結(jié)合到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上。粘附連接不僅將相鄰細(xì)胞依次連接起來(lái)，維持上皮細(xì)胞正常的形態(tài)和極性，而且參與細(xì)胞間及胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的功能。Ras家族小分子量G蛋白對(duì)E-鈣粘蛋白有重要的調(diào)節(jié)作用，Rap1調(diào)控E-鈣粘蛋白介導(dǎo)的粘附連接的形成和定位，，但此過(guò)程中Rap1作用的下游信號(hào)通路仍是未知的。有文獻(xiàn)報(bào)道抑制H-Ras的活性能增強(qiáng)E-鈣粘蛋白的表達(dá)，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞缺乏H-Ras時(shí)表現(xiàn)出較低的增殖和遷移能力，但H-Ras對(duì)E-鈣粘蛋白是否具有調(diào)節(jié)作用尚未定論。為闡明Rap1和H-Ras能否協(xié)同或拮抗地調(diào)節(jié)E-鈣粘蛋白介導(dǎo)的粘附連接的形成，我們使用Ca~(2+)開(kāi)關(guān)模擬粘附連接解體和重建模型，利用GST-Pull down技術(shù)研究了Rap1和H-Ras活性在粘附連接重建過(guò)程中的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞中Rap1和H-Ras在Ca~(2+)饑餓引起的粘附連接解離時(shí)均被激活。此外，通過(guò)Co-IP技術(shù)研究了Rap1和H-Ras在粘附連接重建過(guò)程中相互作用蛋白的變化情況，通過(guò)FRET技術(shù)研究了Rap1和H-Ras在細(xì)胞內(nèi)被激活的位置，研究發(fā)現(xiàn)，Rap1和H-Ras的激活均與Ca~(2+)開(kāi)關(guān)實(shí)驗(yàn)介導(dǎo)的粘附連接重建有關(guān)。Rap1調(diào)節(jié)E-鈣粘蛋白的候補(bǔ)下游因子主要是一些細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白以及小分子量G蛋白的GAPs，H-Ras調(diào)節(jié)E-鈣粘蛋白的下游因子可能也包括一些細(xì)胞骨架蛋白。Rap1起始活化時(shí)核周?chē)幕罨礁哂诩?xì)胞膜處，細(xì)胞膜和胞質(zhì)中的H-Ras活性化水平均在粘附連接解體時(shí)上升，粘附連接重建時(shí)下調(diào)。 通過(guò)本課題的研究，我們能夠進(jìn)一步了解Rap1和H-Ras之間的聯(lián)系以及調(diào)控E-鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附連接的分子機(jī)理。
【關(guān)鍵詞】：Rap1 H-Ras E-鈣粘蛋白 粘附連接 Ca~(2+)開(kāi)關(guān)實(shí)驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-8
• 第1章 緒論8-22
• 1.1 課題背景及研究的目的和意義8
• 1.2 粘附連接簡(jiǎn)介8-12
• 1.2.1 粘附連接的結(jié)構(gòu)8-10
• 1.2.2 細(xì)胞間粘附連接構(gòu)建和解離的動(dòng)態(tài)平衡10-11
• 1.2.3 粘附連接的腫瘤生物學(xué)意義11-12
• 1.3 Ras 家族 G 蛋白簡(jiǎn)介12-15
• 1.3.1 關(guān)于 Rap1 的研究12-13
• 1.3.2 關(guān)于 H-Ras 的研究13-15
• 1.3.3 Rap1 與 H-Ras 的關(guān)系15
• 1.4 Rap1 與 H-Ras 各自的相互作用蛋白15-17
• 1.5 調(diào)控 E-鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附連接的分子機(jī)制17-20
• 1.6 本文的主要研究?jī)?nèi)容20-21
• 1.7 技術(shù)路線21-22
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法22-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-25
• 2.1.1 重組體質(zhì)粒22
• 2.1.2 構(gòu)建 FRET 重組體所需引物22
• 2.1.3 菌株和細(xì)胞系22-23
• 2.1.4 主要試劑材料及試劑配方23-24
• 2.1.5 主要儀器24-25
• 2.1.6 主要分析軟件25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-34
• 2.2.1 重組體的擴(kuò)增與構(gòu)建25-29
• 2.2.2 MCF-7 細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染29-31
• 2.2.3 Ca~(2+)開(kāi)關(guān)實(shí)驗(yàn)31
• 2.2.4 GST-Pull down31-32
• 2.2.5 Co-Immunoprecipitation32
• 2.2.6 Western blot 檢測(cè)蛋白水平32-33
• 2.2.7 Neuhoff 膠體染色33-34
• 2.2.8 激光共聚焦顯微鏡觀察 FRET34
• 2.3 本章小結(jié)34-35
• 第3章 Rap1 和 H-Ras 的活性在粘附連接重建過(guò)程中的變化規(guī)律35-40
• 3.1 GST 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)35-36
• 3.2 建立 MCF-7 細(xì)胞的粘附連接重建模型36
• 3.3 GST-Pull down 和 Western Blot 確定 Rap1 和 H-Ras 的水平36-38
• 3.3.1 粘附連接解體和重建激活 Rap136-37
• 3.3.2 粘附連接解體激活重建抑制 H-Ras37-38
• 3.4 討論38-39
• 3.5 本章小結(jié)39-40
• 第4章 Rap1 和 H-Ras 相互作用蛋白在粘附連接重建中的變化及聯(lián)系40-47
• 4.1 轉(zhuǎn)染 EGFP-C3、EGFP-C3-Rap1、EGFP-C3-H-Ras 的細(xì)胞系40-41
• 4.2 Co-IP 研究 Rap1 和 H-Ras 相互作用蛋白在粘附連接重建中的變化41-43
• 4.3 質(zhì)譜分析43
• 4.4 討論43-45
• 4.5 本章小結(jié)45-47
• 第5章 激活的 Rap1 和 H-Ras 在細(xì)胞內(nèi)的定位47-55
• 5.1 已構(gòu)建 FRET 重組體的驗(yàn)證48-49
• 5.2 轉(zhuǎn)染 FRET 重組體的 MCF-7 細(xì)胞系49
• 5.3 激光共聚焦顯微鏡下定位細(xì)胞內(nèi)激活的 Rap1 和 H-Ras49-53
• 5.3.1 粘附連接重建過(guò)程中 Rap1 激活位置的變化50-51
• 5.3.2 粘附連接重建過(guò)程中 H-Ras 激活位置的變化51-53
• 5.4 討論53-54
• 5.5 本章小結(jié)54-55
• 結(jié)論55
• 展望55-56
• 參考文獻(xiàn)56-63
• 附錄63-66
• 致謝66

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