本文關鍵詞：馬爾尼菲青霉菌LIG4同源基因缺失突變體構建

  更多相關文章： 馬爾尼菲青霉菌 PMlig4基因 非同源末端連接 同源重組 基因打靶

【摘要】：目的馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei,PM)是青霉菌屬中唯一溫度依賴的雙相性條件致病菌,它能在免疫缺陷人群(尤其是HIV感染患者)中引起嚴重的系統(tǒng)性青霉病(Penicilliosis marneffei, PSM)。PM致病機制有待深入研究。隨著PM基因組測序的完成,有必要建立一個高通量的基于同源重組進行定點PM基因敲除方法以用于PM致病機制研究。在真核生物中,外源DNA整合到基因組中是通過兩種DNA雙鏈斷裂(DNA double strand breaks, DSB)修復機制：同源重組(homologous recombination, HR)和非同源末端連接(nonhomologous end joining, NHEJ)�；谝阎溉閯游锛毎袇⑴c非同源末端連接DNA雙鏈斷裂(DNA double strand breaks, DSB)修復途徑的蛋白有ku70、ku80、DNAPKcs、LIG4和XRCC4,通過抑制非同源末端連接DNA雙鏈斷裂(DNA double strand breaks, DSB)修復途徑提高基因打靶效率的方法在絲狀真菌中已經建立。本課題通過基因敲除技術構建馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei, PM)的LIG4同源基因缺失突變體以提高基因打靶效率,為通過基因打靶方法深入研究PM致病分子機制提供一個有力的遺傳操作工具。 方法通過在馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei, PM)基因組數據庫中查找LIG4同源基因,設計特異PCR引物擴增其兩側同源序列并通過融合PCR方法將篩選標記基因pyrG插入兩側同源序列之間構建PMlig4同源基因缺失載體,將該基因缺失載體轉化入馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei, PM)尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株SPM4(pyrG,niaD-)原生質,篩選陽性克隆,提取轉化子DNA,再通過PCR技術驗證獲得LIG4同源基因缺失株。將得到的LIG4同源基因缺失株與原始研究出發(fā)菌株SPM4比較,觀察表型并進一步實驗驗證其同源重組效率。 結果以粗糙脈孢菌(Neuospora crassa) LIG4蛋白序列進行Blastp比對發(fā)現馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei, PM) LIG4同源蛋白由1005個氨基酸殘基組成,與粗糙脈孢菌(Neuospora crassa) LIG4蛋白序列有66%相似性和51%一致性。兩個蛋白均具有保守的BRCT結構域、DNA結合部位和DNA連接酶Ⅳ活性部位。編碼PM的LIG4基因全長ORF共3018bp,共有外顯子3個,內含子2個。 用融合PCR成功構建了以pyrG為篩選標記基因的PMlig4同源基因敲除載體,用已構建好的含pyrG基因馬爾尼菲青霉菌PMlig4基因缺失載體遺傳轉化馬爾尼菲青霉菌尿嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株SPM4原生質體,篩選到尿嘧啶營養(yǎng)缺陷得到互補的轉化子154個,制備基因組DNA并用PCR方法篩選鑒定到PMlig4基因缺失突變株12株。 結論本課題通過融合PCR方法成功構建了含pyrG篩選標記基因的馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei, PM) LIG4同源基因缺失載體,并成功將該基因缺失載體轉化入菌株SPM4(pyrG-, niaD-)原生質,成功構建得到了馬爾尼菲青霉菌LIG4同源基因缺失突變體,為進一步驗證該突變株在基因打靶遺傳操作中的高效性并利用其進行馬爾尼菲青霉菌基因功能和致病分子機制研究打下了良好的基礎。
【關鍵詞】：馬爾尼菲青霉菌 PMlig4基因 非同源末端連接 同源重組 基因打靶
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：Q78;R378
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照表4-5
• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 前言10-13
• 材料方法13-40
• 實驗結果40-48
• 討論48-50
• 結論50-51
• 附錄51-63
• 參考文獻63-67
• 綜述67-82
• 參考文獻78-82
• 致謝82-83
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表文章83

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 劉棟華;劉曉軍;譚升順;;SELDI技術對馬爾尼菲青霉菌酵母相和霉菌相蛋白質組表達差異的分析[J];南方醫(yī)科大學學報;2007年01期

2 鈕蓓蓓;陶菊紅;董輝;湯生榮;任雙喜;;新型馬爾尼菲青霉菌RhoGTPase激活因子的RNAi研究[J];復旦學報(自然科學版);2008年05期

3 趙允謙;陶菊紅;陳小恂;鄭愛霓;任雙喜;;利用RNA干擾沉默馬爾尼菲青霉菌聚酮合酶基因的相關研究[J];復旦學報(自然科學版);2009年01期

4 藍秀萬;藍瑛;林海燕;陳保善;;板栗疫病菌低毒力遺傳轉化株LC的構建[J];廣西農業(yè)生物科學;2007年02期

5 鄧卓霖;;進行性播散性馬氏青霉菌病[J];廣西醫(yī)學院學報;1984年01期

6 王峰;董輝;錢震;陶菊紅;游松;任雙喜;;RNA干擾Fus3基因對二態(tài)性真菌馬爾尼菲青霉菌的孢子形成和細胞壁組分合成功能的影響[J];菌物學報;2009年03期

7 李載平;《分子克隆實驗指南》(第3版)[J];科學通報;2002年24期

8 劉博;付萍;;馬爾尼菲青霉菌病的研究進展[J];皮膚病與性病;2010年01期

9 趙國慶;冉玉平;向耘;;中國大陸馬爾尼菲青霉病的臨床表現及流行病學特征的系統(tǒng)評價[J];中國真菌學雜志;2007年02期

10 賀丹;郭亮;王麗;;人獸共患真菌病的現狀[J];中國真菌學雜志;2007年06期

中國重要會議論文全文數據庫 前1條

1 林新瑜;冉玉平;勾蘭圖;何飛;張瑞峰;代亞玲;;應用基因芯片技術動態(tài)分析馬爾尼菲青霉菌絲相和酵母相差異表達基因[A];中國菌物學會第五屆會員代表大會暨2011年學術年會論文摘要集[C];2011年

，

本文編號：801910