發(fā)布時(shí)間：2017-09-06 03:27

  本文關(guān)鍵詞：馬爾尼菲青霉菌LIG4同源基因缺失突變體構(gòu)建

  更多相關(guān)文章： 馬爾尼菲青霉菌 PMlig4基因 非同源末端連接 同源重組 基因打靶

【摘要】：目的馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei,PM)是青霉菌屬中唯一溫度依賴的雙相性條件致病菌,它能在免疫缺陷人群(尤其是HIV感染患者)中引起嚴(yán)重的系統(tǒng)性青霉病(Penicilliosis marneffei, PSM)。PM致病機(jī)制有待深入研究。隨著PM基因組測(cè)序的完成,有必要建立一個(gè)高通量的基于同源重組進(jìn)行定點(diǎn)PM基因敲除方法以用于PM致病機(jī)制研究。在真核生物中,外源DNA整合到基因組中是通過(guò)兩種DNA雙鏈斷裂(DNA double strand breaks, DSB)修復(fù)機(jī)制：同源重組(homologous recombination, HR)和非同源末端連接(nonhomologous end joining, NHEJ)�；谝阎溉閯�(dòng)物細(xì)胞中參與非同源末端連接DNA雙鏈斷裂(DNA double strand breaks, DSB)修復(fù)途徑的蛋白有ku70、ku80、DNAPKcs、LIG4和XRCC4,通過(guò)抑制非同源末端連接DNA雙鏈斷裂(DNA double strand breaks, DSB)修復(fù)途徑提高基因打靶效率的方法在絲狀真菌中已經(jīng)建立。本課題通過(guò)基因敲除技術(shù)構(gòu)建馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei, PM)的LIG4同源基因缺失突變體以提高基因打靶效率,為通過(guò)基因打靶方法深入研究PM致病分子機(jī)制提供一個(gè)有力的遺傳操作工具。 方法通過(guò)在馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei, PM)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中查找LIG4同源基因,設(shè)計(jì)特異PCR引物擴(kuò)增其兩側(cè)同源序列并通過(guò)融合PCR方法將篩選標(biāo)記基因pyrG插入兩側(cè)同源序列之間構(gòu)建PMlig4同源基因缺失載體,將該基因缺失載體轉(zhuǎn)化入馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei, PM)尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株SPM4(pyrG,niaD-)原生質(zhì),篩選陽(yáng)性克隆,提取轉(zhuǎn)化子DNA,再通過(guò)PCR技術(shù)驗(yàn)證獲得LIG4同源基因缺失株。將得到的LIG4同源基因缺失株與原始研究出發(fā)菌株SPM4比較,觀察表型并進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其同源重組效率。 結(jié)果以粗糙脈孢菌(Neuospora crassa) LIG4蛋白序列進(jìn)行Blastp比對(duì)發(fā)現(xiàn)馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei, PM) LIG4同源蛋白由1005個(gè)氨基酸殘基組成,與粗糙脈孢菌(Neuospora crassa) LIG4蛋白序列有66%相似性和51%一致性。兩個(gè)蛋白均具有保守的BRCT結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合部位和DNA連接酶Ⅳ活性部位。編碼PM的LIG4基因全長(zhǎng)ORF共3018bp,共有外顯子3個(gè),內(nèi)含子2個(gè)。 用融合PCR成功構(gòu)建了以pyrG為篩選標(biāo)記基因的PMlig4同源基因敲除載體,用已構(gòu)建好的含pyrG基因馬爾尼菲青霉菌PMlig4基因缺失載體遺傳轉(zhuǎn)化馬爾尼菲青霉菌尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株SPM4原生質(zhì)體,篩選到尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷得到互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化子154個(gè),制備基因組DNA并用PCR方法篩選鑒定到PMlig4基因缺失突變株12株。 結(jié)論本課題通過(guò)融合PCR方法成功構(gòu)建了含pyrG篩選標(biāo)記基因的馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei, PM) LIG4同源基因缺失載體,并成功將該基因缺失載體轉(zhuǎn)化入菌株SPM4(pyrG-, niaD-)原生質(zhì),成功構(gòu)建得到了馬爾尼菲青霉菌LIG4同源基因缺失突變體,為進(jìn)一步驗(yàn)證該突變株在基因打靶遺傳操作中的高效性并利用其進(jìn)行馬爾尼菲青霉菌基因功能和致病分子機(jī)制研究打下了良好的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：馬爾尼菲青霉菌 PMlig4基因 非同源末端連接 同源重組 基因打靶
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：Q78;R378
【目錄】：

• 中英文縮略詞對(duì)照表4-5
• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 前言10-13
• 材料方法13-40
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-48
• 討論48-50
• 結(jié)論50-51
• 附錄51-63
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 綜述67-82
• 參考文獻(xiàn)78-82
• 致謝82-83
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章83

【參考文獻(xiàn)】

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中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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本文編號(hào)：801910