發(fā)布時間：2017-09-05 12:40

  本文關(guān)鍵詞：微生物來源結(jié)核分枝桿菌蛋白激酶B抑制劑篩選模型的建立和應(yīng)用

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【摘要】：肺結(jié)核(TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis, Mtb)引起的一種嚴重威脅人類健康的慢性傳染病,世衛(wèi)組織《2013年全球結(jié)核病報告》中表明2012年結(jié)核病病人數(shù)為860萬人,全球結(jié)核病死亡數(shù)130萬,盡管感染人數(shù)和死亡人數(shù)均呈現(xiàn)緩慢下降趨勢,但仍面臨著結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥性的危機。同時,抗結(jié)核藥物研發(fā)進展的緩慢更加劇了結(jié)核防治任務(wù)的艱巨性。因此,開發(fā)針對新穎靶點的抗結(jié)核藥物已經(jīng)迫在眉睫。 結(jié)核分枝桿菌中存在11種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PknA-PknL (STPKs)[1],其中PknB廣泛參與到了有關(guān)結(jié)核分枝桿菌生長繁殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在結(jié)核分枝桿菌生長分裂和細胞形態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用,為結(jié)核分枝桿菌生存所必需,可作為抗結(jié)核藥物的篩選靶點之一 本研究表達純化了PknB的N端激酶結(jié)構(gòu)域蛋白,并以其為靶標建立并優(yōu)化了適用于微生物發(fā)酵液樣品篩選的、以NADH比色法為基礎(chǔ)的PknB抑制劑高通量篩選模型,此模型與本實驗室已經(jīng)建立的以螢光素酶法為基礎(chǔ)的PknB抑制劑篩選模型相比,最大的優(yōu)點在于反應(yīng)體系在最后的結(jié)果檢測中不受樣品顏色的干擾,可用于篩選顏色較深的發(fā)酵液樣品。 本研究利用該模型篩選了20000個發(fā)酵液樣品,得到陽性發(fā)酵液樣品56個,其中5株陽性菌株I10A-00359、I10A-00827、I11A-01925、I11A-02040、I11A-02296的發(fā)酵液樣品對結(jié)核分枝桿菌PknB酶活和恥垢分枝桿菌、海分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌的生長均具有抑制作用。其中,陽性樣品I10AA-00359、I11AA-01925和I11AA-02296具有較低的細胞毒性。 本研究為考察這五個陽性樣品的酶活抑制選擇性,表達了結(jié)核分枝桿菌PknH、PknF和人的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT-1,分別建立和優(yōu)化了各蛋白的酶活測定方法。結(jié)合實驗室原有的工作,初步建立了結(jié)核分枝桿菌絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶酶活抑制特異性的評價體系。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品I10AA-00359、I10AA-00827, I11AA-02040和I11AA-02296的酶活抑制選擇性較好。 最后,本研究對5個陽性發(fā)酵液樣品進行了初步的分離,并對分離后各部份進行了抑酶、抗菌活性的測定和細胞毒性及酶活抑制選擇性的評價。結(jié)果顯示,I11A-02040菌株發(fā)酵液上清和菌絲體甲醇抽提后正丁醇萃取部份(D、H)以及I10A-00827菌株發(fā)酵液上清正丁醇萃取部份(D)具有良好的抑酶、抗菌活性,并具有較小的細胞毒性和較好的酶活抑制選擇性,為后續(xù)活性物質(zhì)的分離純化奠定了初步的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 PknB 微生物發(fā)酵液 抑制劑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-9
• Abstract9-10
• 前言10-12
• 實驗材料12-21
• 實驗方法21-45
• 一、基于NADH比色法以PknB為靶點的高通量篩選模型的建立和優(yōu)化21-31
• 1 重組質(zhì)粒pET28a-pknB-N、pET30a-garA在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達21-25
• 2 目的蛋白的純化25-27
• 3 結(jié)核分枝桿菌重組蛋白PknB-N酶活性檢測方法的建立27-28
• 4 結(jié)核分枝桿菌重組蛋白PknB-N酶活測定體系的優(yōu)化28-30
• 5 待測樣品對PknB-N抑制作用的測定30-31
• 6 假陽性結(jié)果的排除31
• 二、結(jié)核分枝桿菌PknB抑制劑細胞水平的性質(zhì)評價31-33
• 1 微稀釋法檢測酶水平陽性樣品的抗菌活性31-32
• 2 MTT比色法檢測陽性發(fā)酵液樣品對細胞存活的影響32-33
• 三、陽性發(fā)酵液樣品體外酶活抑制選擇性評價體系的建立及應(yīng)用33-43
• 1 陽性發(fā)酵液樣品對結(jié)核分枝桿菌肽脫甲�；�(PDF)酶活抑制性評價33-34
• 2 結(jié)核分枝桿菌蛋白激酶H、蛋白激酶F、人蛋白激酶AKT-1的誘導(dǎo)表達34-40
• 3 基于NADH比色法的結(jié)核分枝桿菌重組蛋白PknH、PknF和人的重組蛋白AKT-1酶活性檢測方法的建立40-43
• 四、陽性菌株次級代謝產(chǎn)物的初步處理及活性測定43-45
• 1 五株陽性菌株I10A-00359、I10A-00827、I11A-01925、I11A-02040、I11A-02296的發(fā)酵43
• 2 五株陽性菌株發(fā)酵產(chǎn)物的初步處理43-45
• 實驗結(jié)果及討論45-71
• 一、基于NADH比色法以PknB為靶點的高通量篩選模型的建立和優(yōu)化45-52
• 1 結(jié)核分枝桿菌重組PknB-N、GarA的表達與純化45-46
• 2 結(jié)核分枝桿菌重組PknB-N酶活性檢測體系的優(yōu)化46-51
• 3 發(fā)酵液樣品酶水平的篩選51-52
• 二、復(fù)篩陽性發(fā)酵液樣品細胞水平的活性和毒性評價52-53
• 1 復(fù)篩陽性發(fā)酵液樣品的處理52
• 2 復(fù)篩陽性發(fā)酵液樣品抗菌活性評價52-53
• 3 復(fù)篩陽性發(fā)酵液樣品細胞毒性評價53
• 三、陽性發(fā)酵液樣品體外酶活抑制選擇性評價體系的建立53-66
• 1 pET28a-pknH、pET28a-pknF、pET28a-akt-1質(zhì)粒的構(gòu)建53-55
• 2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達及目的蛋白的誘導(dǎo)表達后可溶性評價55-56
• 3 目的蛋白的純化56-57
• 4 基于NADH比色法PknH、PknF、AKT-1蛋白酶活測定體系的建立57-65
• 5 復(fù)篩陽性發(fā)酵液樣品的酶活抑制選擇性評價65-66
• 四、復(fù)篩陽性菌株次級代謝產(chǎn)物的初步處理及活性測定66-71
• 1 五株陽性菌株發(fā)酵產(chǎn)物的初步處理66
• 2 五株陽性菌株發(fā)酵產(chǎn)物初分后各部份的活性測定及結(jié)果分析66-71
• 小結(jié)71-72
• 參考文獻72-75
• 文獻綜述75-85
• 參考文獻82-85
• 致謝85

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 高鵬;肖春玲;姜威;蔣建東;;Ser/Thr蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)——抗結(jié)核藥物篩選的新靶點[J];國外醫(yī)藥(抗生素分冊);2007年02期

2 唐先兵,司書毅,張月琴;腸球菌肽脫甲�；冈诖竽c桿菌BL21(DE3)中高效表達及其活性檢測[J];中國生物工程雜志;2004年03期

3 張麗蓉;趙莉莉;魏玉珍;李秋萍;王莉?qū)?余利巖;;以肽脫甲酰基酶為靶點的抗結(jié)核藥物高通量篩選模型的建立和應(yīng)用[J];中國醫(yī)藥生物技術(shù);2012年02期

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本文編號：798034