本文關(guān)鍵詞：p38-2G4蛋白在小鼠紅系分化過程的功能初步研究

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【摘要】：紅系細胞分化是一個持續(xù)的多階段過程。正常情況下,哺乳動物成熟紅細胞是由骨髓造血干細胞依次經(jīng)歷定向紅系祖細胞、原幼紅細胞、早幼紅細胞、中幼紅細胞、晚幼紅細胞和網(wǎng)織紅細胞等多個不同的階段發(fā)育分化產(chǎn)生,其終末分化的主要特征是晚幼紅細胞停止分裂并表達血紅蛋白,出現(xiàn)核固縮,核偏位和自然排核,從而形成網(wǎng)織紅細胞,并通過血腦屏障進一步發(fā)育為成熟紅細胞釋放到血液中。在某些致癌因素作用下,紅系造血細胞失去進一步分化為成熟紅細胞的能力而停滯在細胞發(fā)育的某一階段進而引發(fā)疾病或癌癥。 深入研究紅系細胞分化過程已成為國內(nèi)外許多科研人員的工作重心之一。本課題組長期從事紅系分化及白血病發(fā)生機制的研究,前期利用胎肝細胞,FVA細胞及二甲基亞砜誘導MEL細胞紅系分化的差異蛋白質(zhì)組(2-D-gel/MADIA-Tof/Tof)研究時均發(fā)現(xiàn)p38-2G4存在差異性表達。 p38-2G4蛋白最早作為一種DNA結(jié)合蛋白在埃希氏腹水瘤細胞中被發(fā)現(xiàn),屬增殖相關(guān)蛋白(PA2G4)家族,但目前對其研究甚少,主要集中在同家族的人類同源蛋白Ebp1蛋白功能研究上。Ebp1與p38-2G4具有高度同源性,均含有394個氨基酸殘基,僅在4個氨基酸殘基上不同,它對細胞增殖,分化,凋亡等功能均具有重要作用。 本文擬通過p38-2G4蛋白在小鼠紅系分化過程中的功能研究,闡明該家族蛋白對紅系分化的影響,進一步探究紅系分化過程。首先通過Western blot檢測p38-2G4蛋白在幾種小鼠組織和紅系細胞中的表達情況。其次利用聯(lián)苯胺染色檢測紅系分化過程中血紅蛋白的產(chǎn)生和細胞形態(tài)的改變,通過Western blot,免疫細胞化學(ICC)和RT-PCR方法分析p38-2G4在小鼠紅系分化過程中的變化。此外,通過慢病毒轉(zhuǎn)染MEL細胞改變p38-2G4蛋白在MEL細胞中的表達量,進步研究p38-2G4蛋白水平的改變對MEL細胞增殖和分化的影響。為此,針對p38-2G4mRNA的編碼區(qū)設(shè)計兩組干擾序列,構(gòu)建p38-2G4-shRNA1/2-pLK0.1低表達重組載體,另構(gòu)建p38-2G4-pLJM1高表達重組載體,分別與包裝質(zhì)粒pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.2共轉(zhuǎn)導HEK293T細胞,收集病毒。然后將具有侵染力的病毒顆粒轉(zhuǎn)染MEL細胞,利用嘌呤霉素篩選p38-2G4低表達／高表達的MEL穩(wěn)定細胞株。通過MTT和細胞計數(shù)實驗檢測p38-2G蛋白水平的改變對MEL細胞增殖的影響。流式細胞實驗檢測p38-2G4蛋白水平的改變對細胞周期的影響。利用丁酸鈉誘導MEL細胞結(jié)合聯(lián)苯胺染色檢測p38-2G4蛋白水平改變對MEL細胞誘導紅系分化的影響。 Western blot分析結(jié)果顯示p38-2G4蛋白在小鼠胎肝、FVA、DMSO誘導MEL細胞中均具有差異性表達,結(jié)果與之前的雙向電泳基本一致.Western blot結(jié)果顯示p38-2G4蛋白在幾種小鼠組織和紅系細胞中均有表達,且具有兩種亞型,但亞型分布具有組織和細胞特異性。另外,在MEL細胞中進行免疫細胞化學實驗確定p38-2G4蛋白主要定位于細胞質(zhì)而在細胞核中分布甚少。丁酸鈉誘導MEL細胞分化系統(tǒng)中,Western blot,RT-PCR實驗分析顯示p38-2G4在紅系分化過程中具有差異性表達,呈下降的變化趨勢。此外,Western blot結(jié)果顯示p38-2G4高表達和低表達的MEL穩(wěn)定細胞株構(gòu)建成功。MTT實驗和細胞計數(shù)實驗顯示p38-2G4蛋白水平的改變不影響MEL細胞增殖。聯(lián)苯染色結(jié)果顯示p38-2G4蛋白水平的改變可降低MEL誘導分化過程中血紅蛋白的合成。 上述結(jié)果均表明p38-2G4蛋白在小鼠紅系分化過程中具有重要作用,但對MEl細胞增殖沒有顯著性影響,為此,本課題希望能對p38-2G4蛋白參與小鼠紅系分化的機制作進一步的探究。目前已成功構(gòu)建p38-2G4-V51-S3重組載體,擬通過串聯(lián)親和純化技術(shù)發(fā)現(xiàn)與p38-2G4相互作用的蛋白,從而揭示p38-2G4參與小鼠紅系分化的具體機制。
【關(guān)鍵詞】：紅系分化 p38-2G4 MEL 高表達 干擾
【學位授予單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 縮略語9-10
• 目錄10-13
• 第一章 緒論13-20
• 1 研究背景、目的和意義13-15
• 1.1 研究背景13-15
• 1.1.1 小鼠胎肝紅系分化13-14
• 1.1.2 小鼠FVA細胞紅系分化14
• 1.1.3 腫瘤細胞的誘導分化14-15
• 1.2 研究目的及意義15
• 2 p38-2G4的研究概況15-18
• 2.1 Ebp1對細胞增殖的影響17
• 2.2 Ebp1對細胞分化的影響17
• 2.3 Ebp1對細胞凋亡的影響17-18
• 3 研究內(nèi)容及路線18-20
• 第二章 材料和方法20-44
• 1 材料20
• 1.1 細胞株,病毒及動物20
• 1.2 菌株及質(zhì)粒20
• 2 試劑20-23
• 3 儀器23-24
• 4 試劑配制24-27
• 5 實驗方法27-44
• 5.1 小鼠組織樣品的制備27
• 5.2 小鼠胎肝樣品的制備27-28
• 5.3 小鼠FVA細胞樣品的制備28
• 5.4 細胞培養(yǎng)28
• 5.5 免疫印跡28-30
• 5.5.1 蛋白樣品的制備28-29
• 5.5.2 Brandford法蛋白定量29
• 5.5.3 Western blot29-30
• 5.6 半定量PCR30-32
• 5.6.1 細胞總RNA的提取30-31
• 5.6.2 RT-PCR(TOYOBO Revertra Ace qRCR RT kit,code No.FSQ-101試劑盒)31
• 5.6.3 半定量PCR31-32
• 5.7 免疫細胞化學32-33
• 5.7.1 細胞樣品制備32
• 5.7.2 免疫熒光共聚焦顯微技術(shù)32-33
• 5.8 高表達重組載體的構(gòu)建33-35
• 5.8.1 PCR擴增p38-2G4基因33
• 5.8.2 PCR產(chǎn)物的回收33
• 5.8.3 目的片段和質(zhì)粒的雙酶切33
• 5.8.4 酶切產(chǎn)物割膠回收33-34
• 5.8.5 連接34
• 5.8.6 感受態(tài)制備34
• 5.8.7 轉(zhuǎn)化34-35
• 5.8.8 PCR鑒定和雙酶切鑒定35
• 5.8.9 測序鑒定35
• 5.9 低表達重組載體的構(gòu)建35-37
• 5.9.1 短發(fā)夾p38-2G4-shRNA序列的設(shè)計35-36
• 5.9.2 寡核苷酸片段的退火36
• 5.9.3 pLKO.1-TRC克隆載體的雙酶切36
• 5.9.4 連接36-37
• 5.9.5 轉(zhuǎn)化37
• 5.9.6 陽性克隆的鑒定37
• 5.9.7 測序鑒定37
• 5.10 慢病毒的包裝37-39
• 5.10.1 質(zhì)粒的大量制備37-39
• 5.10.2 慢病毒包裝39
• 5.11 穩(wěn)定細胞株的篩選及鑒定39-40
• 5.12 生長曲線/MTT檢測p38-2G4蛋白對MEL細胞增殖的影響40
• 5.12.1 生長曲線40
• 5.12.2 MTT 實驗40
• 5.13 聯(lián)苯胺染色檢測p38-2G4蛋白對MEL細胞分化的影響40
• 5.14 流式細胞術(shù)檢測p38-2G4蛋白對MEL細胞周期的影響(凱基試劑40-41
• 5.15 p38-2G4的串聯(lián)親和純化41-43
• 5.16 數(shù)據(jù)分析43-44
• 第三章 結(jié)果44-62
• 1 p38-2G4蛋白在不同發(fā)育期的胎肝中的表達44-45
• 2 p38-2G4蛋白在FVA細胞中的表達45-46
• 3 p38-2G4蛋白在DMSO誘導MEL細胞分化中的表達46
• 4 p38-2G4在小鼠組織和幾種紅系細胞中的表達譜46-47
• 5 p38-2G4蛋白的亞細胞定位47-48
• 6 p38-2G4蛋白在丁酸鈉誘導MEL細胞分化過程中的表達48-50
• 7 p38-2G4高表達和低表達MEL細胞穩(wěn)定株的構(gòu)建及篩選50-53
• 7.1 p38-2G4-pLJM1高表達MEL細胞穩(wěn)定株的構(gòu)建及篩選50-52
• 7.1.1 p38-2G4-pLJM 1高表達重組載體構(gòu)建50-51
• 7.1.2 p38-2G4-pLJM1高表達MEL細胞穩(wěn)定株的篩選51-52
• 7.2 p38-2G4-pLKO.1低表達MEL細胞穩(wěn)定株的構(gòu)建及篩選52-53
• 8 p38-2G4蛋白對MEL細胞增殖的影響53-55
• 8.1 p38-2G4蛋白高表達對MEL細胞增殖的影響53-54
• 8.2 p38-2G4蛋白低表達對MEL細胞增殖的影響54-55
• 9 p38-2G4蛋白對MEL細胞周期的影響55
• 10 p38-2G4蛋白對MEL細胞分化的影響55-59
• 10.1 p38-2G4蛋白高表達對MEL細胞分化的影響56-57
• 10.2 p38-2G4蛋白低表達對MEL細胞分化的影響57-59
• 11 p38-2G4蛋白相關(guān)蛋白的研究59-62
• 11.1 p38-2G4-V51-S3重組載體的構(gòu)建59-60
• 11.2 p38-2G4-V51-S3重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞60-62
• 第四章 討論62-64
• 第五章 結(jié)論和展望64-65
• 1 結(jié)論64
• 2 展望64-65
• 參考文獻65-69
• 致謝69

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 羅長纓;胎肝造血前體細胞特征及其臨床應用的研究進展[J];中國當代兒科雜志;2003年05期

2 李賽,馬靜,葛曄華,薛社普,韓代書;原紅細胞在體外EPO誘導下的增殖分化特征[J];中國組織化學與細胞化學雜志;2003年01期

3 駱一西;孫健;余優(yōu)成;;Ebp1、E-cadherin、ICAM-1、MMP-9在唾液腺腺樣囊性癌中的表達及臨床意義[J];上海口腔醫(yī)學;2013年01期

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本文編號：785546