本文關(guān)鍵詞：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備及其向感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)研究

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【摘要】：目的： 對(duì)大鼠BMSCs的體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、鑒定及其向感覺(jué)神經(jīng)元誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化,建立本實(shí)驗(yàn)室快速穩(wěn)定獲取大鼠BMSCs及其轉(zhuǎn)化為感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞技術(shù)流程,為BMSCs內(nèi)耳移植治療感音神經(jīng)性耳聾提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)規(guī)范。 方法： 1、體外利用密度梯度離心法采集分離培養(yǎng)純化大鼠BMSCs,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD44、CD90、CD106、CD34、CD45表達(dá)情況，成骨及成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)所獲得細(xì)胞向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化,以茜素紅及油紅O染色法鑒定成骨分化中鈣結(jié)節(jié)及脂肪分化中脂滴的形成。 2、用兩步法誘導(dǎo)大鼠BMSCs為感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞：第一步用添加EGF和IGF-1誘導(dǎo)液誘導(dǎo)BMSCs為內(nèi)耳神經(jīng)前體細(xì)胞,細(xì)胞免疫熒光驗(yàn)證其表面蛋白SOX2和PAX8表達(dá)情況,第二步分別用BMP4誘導(dǎo)組和無(wú)BMP4誘導(dǎo)組繼續(xù)向感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo),通過(guò)realtime-PCR比較各組間細(xì)胞內(nèi)NeuroD、Neurog1、GluR4、NF-M基因mRNA水平,選取最優(yōu)誘導(dǎo)方案。最后通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞表面蛋白Nestin、NeuN、GATA3、Calretinin、 β-Ⅲ tubulin、Tau表達(dá)情況,對(duì)最優(yōu)方案誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 結(jié)果： 1、通過(guò)規(guī)范化細(xì)胞制備技術(shù)獲取大量形態(tài)均一貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：細(xì)胞表面抗原CD44、CD90、CD106分別表達(dá)為99.9%、77.3%、99.5%；造血細(xì)胞來(lái)源的表面抗原CD34和CD45分別表達(dá)為3.22%和4%。成脂誘導(dǎo)后油紅O染色可見(jiàn)脂滴,成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色可見(jiàn)橙紅鈣結(jié)節(jié),證實(shí)我們獲取大量高純度的BMSCs。 2、Realtime-PCR結(jié)果顯示BMP、SHH和RA聯(lián)合誘導(dǎo)能顯著提升大鼠BMSCs內(nèi)NeuroD、Neurog1、GluR4、NF-M基因mRNA水平。誘導(dǎo)后細(xì)胞具有神經(jīng)元特殊形態(tài),處于生長(zhǎng)平臺(tái)期,感覺(jué)神經(jīng)元相關(guān)蛋白Nestin、NeuN、GATA3、Calretinin、β-Ⅲ tubulin、Tau陽(yáng)性,證實(shí)我們成功的將BMSCs誘導(dǎo)為感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞。 結(jié)論： 1、本實(shí)驗(yàn)成功建立和優(yōu)化了BMSCs制備技術(shù),規(guī)范了細(xì)胞采集、分離、培養(yǎng)及鑒定的流程,為獲取高質(zhì)量BMSCs提供了理論和實(shí)踐參考。 2、本實(shí)驗(yàn)成功建立了BMSCs誘導(dǎo)為感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)；通過(guò)realtime-PCR技術(shù)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)證明BMP4、SHH和RA聯(lián)合誘導(dǎo)可獲得高質(zhì)量感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng) BMP4 誘導(dǎo)分化 感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 英文~.略詞11-12
• 前言12-14
• 第一章 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備技術(shù)14-24
• 1.1 引言14
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑14-16
• 1.2.1 材料14
• 1.2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器及耗材14-15
• 1.2.3 主要試劑和藥品15-16
• 1.2.4 主要試劑的配制與保存16
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法16-20
• 1.3.1 大鼠BMSCs分離及培養(yǎng)16-18
• 1.3.2 BMSCs傳代18
• 1.3.3 BMSCs凍存及復(fù)蘇18-19
• 1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)19
• 1.3.5 體外誘導(dǎo)BMSCs向成骨分化及茜素紅染色19
• 1.3.6 體外誘導(dǎo)BMSCs成脂分化及油紅O染色19-20
• 1.4 結(jié)果與分析20-22
• 1.4.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化20-21
• 1.4.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)21-22
• 1.4.3 體外誘導(dǎo)BMSCs向成骨成脂分化22
• 1.5 討論22-23
• 1.5.1 大鼠BMSCs的采集分離培養(yǎng)純化22
• 1.5.2 BMSCs的鑒定22-23
• 1.6 小結(jié)23-24
• 第二章 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)及鑒定24-40
• 2.1 引言24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑25-27
• 2.2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器及耗材25-26
• 2.2.2 主要試劑和藥品26-27
• 2.2.4 主要試劑的配制與保存27
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法27-31
• 2.3.1 BMSCs向感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程27-28
• 2.3.2 細(xì)胞免疫熒光28-29
• 2.3.3 總RNA的提取29
• 2.3.4 cDNA合成29-30
• 2.3.5 實(shí)時(shí)定量PCR30-31
• 2.3.6 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線31
• 2.3.7 圖像獲取及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法31
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-37
• 2.4.1 向OPs細(xì)胞誘導(dǎo)31-33
• 2.4.2 BMP4顯著提升BMSCs的感覺(jué)神經(jīng)元相關(guān)蛋白的表達(dá)33-34
• 2.4.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)34-36
• 2.4.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線36
• 2.4.5 細(xì)胞免疫熒光36-37
• 2.5 討論與分析37-39
• 2.5.1 大鼠BMSCs向感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化37-38
• 2.5.2 誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定38-39
• 2.6 小結(jié)39-40
• 全文結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 綜述45-53
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 致謝53

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