本文關(guān)鍵詞：SELEX技術(shù)篩選鈣通道特異性核酸適配體及其抗肥大細(xì)胞活化的作用

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【摘要】：目的篩選針對Orai1分子第1膜外區(qū)蛋白的核酸適配體,探討適配體通過拮抗鈣離子釋放激活通道(Ca2+release activation channel,CRAC)抑制肥大細(xì)胞活化的效應(yīng)。方法構(gòu)建隨機單鏈DNA文庫,利用不對稱PCR對單鏈DNA文庫進行擴增。采用聚苯乙烯酶聯(lián)板為介質(zhì)的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技術(shù)篩選核酸適配體。利用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測各輪篩選序列與靶蛋白的親和力,驗證適配體與靶蛋白的特異性結(jié)合;激光共聚焦顯微鏡觀察適配體對細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化的影響;利用IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒模型,觀察適配體對β-氨基己糖苷酶釋放的抑制效應(yīng)。結(jié)果經(jīng)過12輪SELEX篩選,獲得了7條核酸適配體,其中AptamerY1解離常數(shù)(Kd值)為1.72×10-8mol/L。以終濃度2μg/mL的AptamerY1可抑制由IgE介導(dǎo)的人肥大細(xì)胞系LAD2鈣離子內(nèi)流,并對LAD2細(xì)胞的β-氨基己糖苷酶釋放抑制率達95%。結(jié)論通過SELEX篩選,獲得了7條針對Orai1分子第1膜外區(qū)的核酸適配體,所獲得適配體可對肥大細(xì)胞LAD2鈣內(nèi)流有效抑制,進而抑制肥大細(xì)胞活化和β-氨基己糖苷酶的釋放。
【作者單位】： 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所皮膚科;第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥理學(xué)教研室;第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院全軍復(fù)合傷研究所 創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室;
【關(guān)鍵詞】： 肥大細(xì)胞 SELEX適體技術(shù) 鈣離子釋放激活通道 β-氨基己糖苷酶
【基金】：國家自然科學(xué)基金(30972647)~~
【分類號】：R346
【正文快照】： 2006年Feske等[1]識別出一種新蛋白,命名為Orai1,證實了Orai1蛋白是鈣離子釋放激活通道(Ca2+release activation channel,CRAC)的組成部分。20世紀(jì)90年代,SELEX技術(shù)[2]問世,由此獲得的適配體可與靶分子高特異性和高親和力地結(jié)合。適配體的另外一個優(yōu)點是沒有免疫原性[3],故在

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本文編號：780179