本文關(guān)鍵詞：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞exosome提取及其心肌細(xì)胞H9C2靶向作用的實驗探索

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【摘要】：目的 (1)探索分步離心結(jié)合超速離心的方法能否成功分離缺氧預(yù)處理條件下大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的exosome。 (2)分析獲取缺氧預(yù)處理下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的exosome顆粒的直徑分布范圍、平均半徑等特征。 (3)探索心肌細(xì)胞H9C2是否是缺氧預(yù)處理條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的exosome的生物學(xué)作用靶細(xì)胞之一。 (4)探索缺氧預(yù)處理條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的exosome被心肌細(xì)胞H9C2攝取的時間特征。 方法 (1)采用目前成熟的方法提取大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代,培養(yǎng)并傳代純化至3-6代。 (2)采用目前公認(rèn)的方法對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行缺氧預(yù)處理,進(jìn)一步地,采用分步離心結(jié)合超速離心的方法分離提取培養(yǎng)上清液中干細(xì)胞分泌的exosome囊體顆粒。 (3)采用低分辨率透射電鏡直接觀察提取物的特征,以最直觀的方式鑒定提取物是否為exosome,并為進(jìn)一步的獲取exosome這種微型囊體的特征性數(shù)據(jù)奠定基礎(chǔ)。 (4)采用SDS-PAGE凝膠電泳系統(tǒng)來檢測提取物exosome顆粒中CD63分子和CD9分子的表達(dá)情況,以鑒定提取物是否為exosomes。 (5)根據(jù)透射電鏡鑒定結(jié)果,本實驗采用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0對透射電鏡圖片中exosome的數(shù)據(jù)進(jìn)行采集,采用Excel作圖工具和統(tǒng)計分析軟件Graph Pad5.0對采集得到的exosome顆粒數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計,以首次獲得大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的exosomes的直徑分布區(qū)間和平均半徑等特征. (6)采用綠色熒光染料PKH-67對exosome進(jìn)行熒光染色標(biāo)記,將標(biāo)記的exosome與心肌細(xì)胞H9C2共孵育,熒光顯微鏡下示蹤觀察exosome能否夠被心肌細(xì)胞H9C2攝取,以明確心肌細(xì)胞是否是干細(xì)胞來源exosome勺生物學(xué)作用靶點之一。進(jìn)一步,將標(biāo)記的exosomes與心肌細(xì)胞H9C2共孵育不同的時間段,以探索exosome被心肌細(xì)胞H9C2攝取的情況隨時間的變化特征。 結(jié)果 (1)透射電鏡隨機(jī)視野下可以看到提取物呈微型囊體結(jié)構(gòu),形態(tài)近似球形或者橢球形,大小均一,均勻分散的分布在視野中,故可以排除提取物是蛋白質(zhì)的可能性。 (2)據(jù)報道凋亡小體是凋亡細(xì)胞程序性裂解后產(chǎn)生的細(xì)胞碎片,其直徑分布范圍為100-1000nm,經(jīng)透射電鏡隨機(jī)視野觀察,本實驗提取物直徑集中分布在20-60nm范圍,故又可排除提取物是凋亡小體的可能性。 (3) Western blot鑒定結(jié)果顯示,本提取物均陽性表達(dá)CD63和CD9分子,且較CD63分子,缺氧預(yù)處理培養(yǎng)下,大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞exosomes更高表達(dá)CD9分子。據(jù)此鑒定結(jié)果,我們可以排除該提取物為microvesicle(?)micropaticle的可能性。因此可以證明提取物即是exosomeso (4)經(jīng)圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0(?)excel數(shù)據(jù)分析顯示,大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的exosomes直徑在20-60nm左右,且分布比較集中。 (5)經(jīng)Graph Pad5.0統(tǒng)計學(xué)軟件對分離提取的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的exosomes進(jìn)行半徑和直徑的統(tǒng)計學(xué)分析,我們證明,缺氧預(yù)處理條件下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞exosome最小半徑2nm,最大半徑31nm,半徑25%分位數(shù)為13nm,半徑75%分位數(shù)為21nm,半徑中位數(shù)為17nm,exosome半徑平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差為17.03±0.4016nm。 (6)Exosome與心肌細(xì)胞H9C2共孵育實驗結(jié)果顯示,僅實驗組H9C2細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量的exosomes綠色熒光顆粒。 (7)探索H9C2攝取exosomes的時間特征的實驗中,通過對照組4個亞組和實驗組0+2h、0+3h、0+4h亞組,我們排除了熒光標(biāo)記的exosome熒光顆粒數(shù)量和熒光強(qiáng)度隨時間的自發(fā)淬滅現(xiàn)象對實驗結(jié)果的影響,明確了H9C2細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的exosome顆粒數(shù)量僅與exosome和H9C2共孵育的時間相關(guān)。實驗組各亞組顯示,標(biāo)記的exosome和心肌細(xì)胞H9C2共孵育1h,H9C2細(xì)胞質(zhì)中即開始觀察至exosome綠色熒光顆粒,exosome與H9C2共孵育1.5-2.5h,H9C2細(xì)胞質(zhì)中exosome綠色熒光顆粒數(shù)量較其他亞組多,熒光強(qiáng)度較其他亞組強(qiáng)。 結(jié)論 經(jīng)過透射電鏡(?)western blot鑒定證明,本實驗采用分布離心結(jié)合蔗糖／重水墊超速離心的方法,成功的提取到了缺氧預(yù)處理條件下的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞exosomes;并且證明該分離提取方法具有較為理想的效果；通過excel和Graph Pad5.0統(tǒng)計分析,我們首次明確了缺氧預(yù)處理條件下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞exosome直徑分布集中在20-60nm區(qū)間,平均直徑為34.06nnm；通過exosome和心肌細(xì)胞H9C2的共孵育實驗,我們證明了缺氧預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞exosomes能被心肌細(xì)胞H9C2高效率地攝取,因此可以明確,心肌細(xì)胞H9C2是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞exosome的生物學(xué)作用靶細(xì)胞之一；同時我們證明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞exosomes和心肌細(xì)胞H9C2共孵育1.5-2.5h后,心肌細(xì)胞對exosome的攝取量達(dá)到高峰。
【關(guān)鍵詞】：缺氧預(yù)處理 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 exosome H9C2 心力衰竭 缺血再灌注損傷
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 符號說明12-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-31
• 結(jié)果31-34
• 討論34-37
• 研究意義37-39
• 創(chuàng)新性和局限性39
• 結(jié)論39-41
• 附表和附圖41-50
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 致謝55-56
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)位論文目錄56-57
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表57

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