本文關鍵詞：腸道病毒71型不同毒力表型分離株感染ICR鼠的研究

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【摘要】：腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科(Picornavirdae),腸道病毒屬(Enterovirus, EV)。EV71是導致手足口病(HFMD)最為常見的病原體之一,通常引起患者手、足、口腔等部位皮膚粘膜的皮疹、皰疹,可自愈。個別可累及中樞神經系統,主要表現為無菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓灰質炎樣麻痹等,以嬰幼兒和5歲以下兒童感染為主,致殘及病死率較高。 近年來EV71病毒感染在亞太國家和地區(qū)的流行呈上升趨勢。然而,目前仍沒有特效的藥物或疫苗用于EV71感染的防治,EV71的致病機制也不明了。動物模型是進行病毒致病機制、感染特點的研究和病毒疫苗及藥物療效評價的重要手段,但目前尚未找到可用于EV71研究的動物模型。本研究針對目前我國EV71動物模型方面研究的匱乏與病毒分子機制研究的需要,運用分離自山東臨沂手足口病患兒的EV71分離株SDLY107與SDLY11株進行實驗,以期建立一個不同毒力表型分離株的EV71動物感染模型,旨在探討EV71不同毒力表型分離株引起不同臨床表現的原因。 本次研究采用EV71山東分離株SDLY107(死亡患兒分離株)、SDLY11(僅表現皮疹和發(fā)熱的輕癥患兒分離株)分別對1日齡,2周齡ICR乳鼠經腹腔注射感染,同時對感染小鼠進行了臨床表現、病原學、病毒分子生物學和病理學等方面的研究,從而建立起EV71不同毒力表型分離株小鼠感染模型,對今后開展EV71毒力相關致病機制的研究具有重要意義。 目的 1.比較EV71輕重癥分離株感染不同日齡ICR小鼠后的感染特點,為進一步研究EV71感染后引起不同癥狀的原因提供依據。 2.用本實驗室建立的SYBR GreenI實時熒光定量RT-PCR測定EV71RNA病毒拷貝數的方法,檢測EV71輕、重癥分離株分別感染1日齡和2周齡小鼠后肌肉組織EV71RNA拷貝數,評價輕、重癥分離株在小鼠體內復制情況的差異。 3. ELISA試驗法逐日測定1日齡和2周齡小鼠血清中EV71抗體滴度,評價輕、重癥分離株病毒分別感染后宿主的抗體生成情況,從而判斷病毒在宿主體內的中和情況,為進一步研究SDLY107與SDLY11感染小鼠后產生不同毒力的原因提供依據。 方法 1.采用EV71山東分離株SDLY107(死亡患兒分離株)、SDLY11(僅表現皮疹和發(fā)熱的輕癥患兒分離株)分別對1日齡,2周齡ICR乳鼠經腹腔注射感染(CCID50均為10-4)。 2.將動物按日齡及處理方式分組,分別為1日齡SDLY107株實驗A組、1日齡SDLY107株實驗B組、1日齡SDLY11株實驗C組、1日齡SDLY11株實驗D組、1日齡對照組E組、2周齡SDLY107株實驗F組、2周齡SDLY107株實驗G組、2周齡SDLY11株實驗H組、2周齡SDLY11株實驗I組2周齡對照組J組,每組5-10只,通過腹腔注射途徑感染,其中對照組用生理鹽水感染。 3.病毒接種后觀察小鼠臨床表現并于3d、4d、5d、6d、7d采集1日齡SDLY107株實驗A組、1日齡SDLY11株實驗C組、2周齡SDLY107株實驗F組、2周齡SDLY11株實驗H組肺、腦、腸、肌肉組織。 4.將1日齡SDLY107株實驗B組、1日齡SDLY11株實驗D組、2周齡SDLY107株實驗G組、2周齡SDLY11株實驗I組、1日齡對照組E組及2周齡對照組F組小鼠連續(xù)兩周每天取一只摘眼球取血,用間接ELISA試驗法檢測小鼠血清抗體滴度,并取其肌肉組織進行病毒拷貝數的測定。 5.建立SYBR Green I熒光染料實時定量RT-PCR測定EV71病毒載量的方法。使用含有目的序列RNA標準品制備標準曲線,同時對該方法的特異性、靈敏度、重復性進行評估,并對小鼠體內各組織中的病毒拷貝數進行準確定量。 結果 1.ICR1日齡乳鼠和2周齡乳鼠分別經腹腔注射感染SDLY107、SDLY11分離株后,SDLY107分離株感染的乳鼠表現出明顯的癥狀,包括豎毛、弓背、消瘦、肢體麻痹,SDLY11分離株感染的乳鼠癥狀明顯較輕,對照組(生理鹽水)乳鼠無明顯變化。各組織病理檢查發(fā)現,SDLY107與SDLY11感染的乳鼠各臟器均表現出病理變化,SDLY107病理變化更明顯,對照組未觀察到病理變化。 2.建立了SYBR Green I熒光染料實時定量RT-PCR法測定EV71病毒RNA拷貝數的方法。該方法敏感性高、穩(wěn)定性好,可用于EV71病毒RNA的定量測定。實時熒光定量RT-PCR檢測結果表明,SDLY107在各組織中的病毒載量均高于SDLY11,肌肉組織中病毒載量最高。感染SDLY107的1日齡乳鼠肌肉組織病毒拷貝數于5d達到最高值,為6.02×104copies/μl。感染SDLY11的1日齡乳鼠肌肉組織病毒拷貝數于7d達到最高值,為3.27×104copies/μl。 3. ELISA結果顯示,隨著感染天數的增加,小鼠血清抗體的A值檢出增加,其中1日齡小鼠的血清抗體A值最高出現在7d,2周齡小鼠的血清抗體A值最高出現在8d。2周齡小鼠的血清產生抗體水平明顯高于1日齡小鼠。相同日齡小鼠感染SDLY107和SDLY11,血清抗體A值具有相同的趨勢。 結論 1.不同毒力表型的分離株在ICR乳鼠感染中表現出不同致病能力。 2.不同毒力表型的分離株在ICR乳鼠體內表現出不同的復制能力。這種復制能力的不同可能與感染后引起不同臨床表型有關,而復制能力的改變可能取決于病毒自身與復制有關的區(qū)域關鍵氨基酸突變,也與宿主自身產生抗體對病毒的消除作用有關。 3.本研究建立的SYBR Green I熒光染料實時定量RT-PCR法測定EV71病毒RNA拷貝數的方法。該方法敏感性高、穩(wěn)定性好,可用于EV71病毒RNA的定量測定,為評價動物體內病毒載量、建立動物模型及疫苗和藥物的研發(fā)打下了基礎。
【關鍵詞】：腸道病毒71型 ICR乳鼠 毒力 實時定量RT-PCR
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 符號說明13-15
• 前言15-22
• 一、腸道病毒71型及其流行病學概況15-16
• 二、腸道病毒71型感染的致病機制16-18
• 三、腸道病毒71型的動物模型研究現狀18-22
• 材料與方法22-36
• 一、材料22-26
• 二、方法26-36
• 結果36-49
• 一、EV71感染ICR小鼠的實驗結果36-43
• 二、實時熒光定量RT-PCR測定EV71RNA拷貝數方法的建立結果43-45
• 三、EV71感染小鼠病毒載量檢測結果45-47
• 四、ELISA檢測小鼠樣本中EV71結果47-49
• 討論49-54
• 一、EV71不同分離株感染ICR小鼠的實驗結果分析50
• 二、實時熒光定量RT-PCR測定EV71RNA拷貝數方法的建立結果50-51
• 三、病毒載量測定和ELISA結果分析51-54
• 結論54-55
• 創(chuàng)新之處55-56
• 附錄、附圖56-59
• 參考文獻59-64
• 致謝64-65
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文65-66
• 學位論文評閱及答辯情況表66

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前9條

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本文編號：770000