本文關(guān)鍵詞：HO-1增強大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞活性及其免疫調(diào)節(jié)作用

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【摘要】：目的：(1)探討血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1, HO-1)對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BM MSCs)自身活性的影響。(2)探討HO-1基因修飾的BM MSCs (HO-1/MSCs)在體外對淋巴細胞的影響及其機制。 方法：(1)選用4-5周齡清潔級雄性Wistar大鼠,處死消毒后取其長骨,用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,收集沖洗液,采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法分離培養(yǎng)并擴增BM MSCs。倒置顯微鏡下觀察BM MSCs細胞形態(tài),熒光標記抗體與細胞孵育后,流式細胞術(shù)鑒定第3代細胞的表型,并檢測其誘導(dǎo)分化為脂肪細胞和成骨細胞的能力。(2)用載有HO-1基因的重組腺病毒載體感染BM MSCs,形成HO-1/BM MSCs,在熒光顯微鏡下觀察其轉(zhuǎn)染率。提取細胞總RNA和總蛋白,分別應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR法和Western印跡法分析細胞內(nèi)HO-1mRNA和蛋白的表達水平并計算HO-1的表達差異。(3)將第3代BM MSCs和HO-1/BM MSCs接種在E-Plate電極板中,用含10%FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)至貼壁后,更換為低血清(2%FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)液,并用二氯化鈷(CoCl2)處理細胞12小時,建立缺血缺氧的環(huán)境。采用實時細胞分析儀分析細胞生長速度,繪制生長曲線,并用Annexin V/PI染色和流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。(4)混合淋巴細胞培養(yǎng)：將HO-1/BM MSCs及對照組GFP/BM MSCs與大鼠脾淋巴細胞、刀豆蛋白(Concanavalin, ConA)建立共培養(yǎng)體系,混合培養(yǎng)0h、24h和48h后,用MTT法檢測淋巴細胞的增殖活性,碘化丙啶染色流式細胞術(shù)分析細胞周期的分布情況,ELISA法檢測細胞因子含量,流式細胞術(shù)分析T淋巴細胞亞群及其活化標志CD25、CD71的表達。 結(jié)果：(1)體外成功培養(yǎng)和擴增出大鼠BM MSCs。細胞貼壁生長,傳代后的細胞呈長梭形,部分呈漩渦或菊花狀排列,具備典型的MSCs形態(tài)特征。細胞表面標記檢測顯示,CD29、CD90和RT1A均為陽性,陽性率分別為99.49%、90.12%和98.99%；而CD34、CD45和RT1B均為陰性,陰性率均95%。細胞能夠誘導(dǎo)分化成為脂肪細胞(油紅O染色示胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅色脂滴)和成骨細胞(von Kossa染色示細胞中出現(xiàn)黑色鈣鹽)。(2)用表達HO-1基因的重組腺病毒感染BM MSCs48h后,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞中綠色熒光表達陽性率80%。實時熒光定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),HO-1基因表達明顯上調(diào),表達量約為對照細胞的5倍。Western印跡結(jié)果顯示,與對照組相比,HO-1/BM MSCs中HO-1蛋白的表達量明顯提高。(3)生長曲線顯示,在正常培養(yǎng)條件下,載有HO-1基因的腺病毒感染對BM MSCs增殖沒有明顯的影響。但在缺血缺氧條件下,HO-1/MSCs的增殖活性明顯強于對照組。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,在正常培養(yǎng)條件下,HO-1/BM MSCs組和對照組細胞凋亡率均很低,但在缺血缺氧條件下,HO-1/BM MSCs組凋亡細胞百分數(shù)明顯低于對照組。(4) HO-1/BM MSCs參與共培養(yǎng)的T淋巴細胞的增殖活性和細胞周期進程均被抑制,促炎因子(IL-2、TNF-α和IFN-y)的分泌量降低、抗炎因子(IL-10)的分泌量升高,T淋巴細胞亞群分化比例降低,同時T淋巴細胞活化標志CD25和CD71的表達降低,與BM MSCs組相比有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：(1) BM MSCs是一類具有多向分化潛能的干細胞,采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁法可分離、純化大鼠BM MSCs,方法簡單,費用低廉,可以作為培養(yǎng)大鼠BM MSCs的常規(guī)方法。(2)用載有HO-1基因的重組腺病毒感染大鼠BM MSCs后,HO-1蛋白的表達明顯增強。(3)在缺血缺氧條件下,HO-1能夠促進BM MSCs增殖并抑制其凋亡。(4)與親代BM MSCs相比,HO-1/BM MSCs能夠更好地發(fā)揮對淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)作用。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細胞 血紅素加氧酶-1 細胞活性 淋巴細胞 免疫調(diào)節(jié)
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• ~.略語/符號說明11-12
• 前言12-16
• 研究現(xiàn)狀、成果12-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、BMMSCs的體外分離、培養(yǎng)和鑒定16-24
• 1.1 材料和方法16-18
• 1.1.1 實驗材料16-17
• 1.1.2 實驗方法17-18
• 1.2 結(jié)果18-22
• 1.2.1 BMMSCs的分離純化、培養(yǎng)擴增18
• 1.2.2 BM MSCs表型鑒定18-21
• 1.2.3 BM MSCs誘導(dǎo)分化能力鑒定21-22
• 1.3 討論22-23
• 1.4 小結(jié)23-24
• 二、HO-1對大鼠BM MSCs自身活性的影響24-31
• 2.1 材料和方法24-25
• 2.1.1 實驗材料24
• 2.1.2 實驗方法24-25
• 2.1.3 統(tǒng)計分析25
• 2.2 結(jié)果25-29
• 2.2.1 重組腺病毒載體成功介導(dǎo)HO-1在BM MSCs中的表達25-27
• 2.2.2 HO-1對BM MSCs增殖的影響27
• 2.2.3 HO-1對BM MSCs凋亡的影響27-29
• 2.3 討論29-30
• 2.4 小結(jié)30-31
• 三、HO-1修飾的BM MSCs在體外對淋巴細胞的影響31-39
• 3.1 材料和方法31-32
• 3.1.1 實驗材料31
• 3.1.2 實驗方法31-32
• 3.1.3 統(tǒng)計學(xué)方法32
• 3.2 結(jié)果32-37
• 3.2.1 HO-1/BM MSCs對淋巴細胞增殖的抑制作用33-35
• 3.2.2 HO-1/BM MSCs對淋巴細胞分泌細胞因子的影響35
• 3.2.3 HO-1/MSCs對T淋巴細胞亞群分化及表面活化標志表達的影響35-37
• 3.3 討論37-38
• 3.4 小結(jié)38-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻40-44
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明44-45
• 附錄45-49
• 綜述 小腸移植與腸道微生態(tài)變化49-56
• 綜述參考文獻53-56
• 致謝56

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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本文編號：762876