發(fā)布時(shí)間：2017-08-31 00:11

  本文關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌PAO1 lasI、rhlI基因缺失菌株的構(gòu)建及其對接合的影響

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【摘要】：目的： 細(xì)菌與細(xì)菌之間存在交流,許多種類的細(xì)菌可以根據(jù)特定信號分子的濃度來監(jiān)測周圍環(huán)境中自身或其它細(xì)菌的數(shù)量變化,當(dāng)環(huán)境中信號分子達(dá)到一定濃度閾值時(shí),信號分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與胞內(nèi)受體結(jié)合啟動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)來適應(yīng)環(huán)境的變化,這一調(diào)節(jié)體系即為細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum Sensing System, QS)或密度感應(yīng)系統(tǒng),也稱自誘導(dǎo)(autoincer, AIs)[1]。 在銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)中,至少存在兩套基于AHLs(Acyl-homoserine lactone,或HSL,即高絲氨酸內(nèi)酯)調(diào)節(jié)的QS系統(tǒng)：一種是控制細(xì)胞外毒力因子表達(dá)的1as系統(tǒng),另一種是控制幾種二級代謝所需產(chǎn)物的rhl系統(tǒng)。las系統(tǒng)由LasR和Lasl組成,rhl系統(tǒng)則由RhlR和RhlI組成。LasR和RhlR為信號分子受體,而LasI和RhlI則分別是HSL信號分子N-3-oxododecanoyl-L-homoserinelactone(3-oxo-C12-HSL或OdDHL)和N-butanoyl-L-homoserinelaetone(C4-HSL,或BHL)的合成酶,分別由lasI和rhlI基因編碼合成。QS系統(tǒng)中,存在著一定的級聯(lián)關(guān)系,有研究表明las系統(tǒng)在這種級聯(lián)關(guān)系中處于最高層,可以激活另外一些調(diào)節(jié)器的轉(zhuǎn)錄表達(dá),如RhlR/RhlI;在QS這個(gè)調(diào)控的關(guān)系網(wǎng)中,Las系統(tǒng)的作用是最主要的,它能調(diào)控Rhl,使3-oxo-C12-HSL的分泌不受C4-HSL的影響。 PA是一種臨床常見的革蘭陰性條件致病菌,隨著抗生素的廣泛應(yīng)用和不合理使用,使得PA對抗生素的耐藥程度日趨嚴(yán)重,泛耐、全耐的PA層出不窮,給臨床PA感染的治療帶來了極大的困難,PA的耐藥主要由兩種機(jī)制引起：一是染色體上結(jié)構(gòu)基因發(fā)生點(diǎn)突變、插入或缺失,引起編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列發(fā)生改變,導(dǎo)致對抗菌藥物的敏感性降低或喪失,如外膜孔蛋白OprD2缺失、青霉素結(jié)合蛋白靶位改變等；二是通過細(xì)菌間耐藥基因水平轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer, HGT)獲得耐藥基因。耐藥基因水平轉(zhuǎn)移方式有轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化和接合,而接合(conjugation)是耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的一個(gè)主要方式,調(diào)節(jié)接合轉(zhuǎn)移的機(jī)制很多,但目前尚不十分清楚。有研究表明,�；呓z氨酸內(nèi)酯(acylated homoserine lactones, HSL)在根癌土壤桿菌Ti質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移中起重要作用,但在PA耐藥基因水平轉(zhuǎn)移中是否發(fā)揮作用尚未見報(bào)道。 為給研究HSL在銅綠假單胞菌中接合反應(yīng)中的作用奠定更好的基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)分別對PA01菌株lasI、rhlI基因進(jìn)行單、雙突變,構(gòu)建突變菌株,并在此基礎(chǔ)上研究HSL對接合反應(yīng)頻率的影響。 方法： 1.構(gòu)建PA01lasI、rhlI基因分別單、雙缺失突變的菌株采用同源重組的方式,首先通過PCR擴(kuò)增lasI、rhlI的上下游片段,分別插入pMDl8、pUCl9,然后在此基礎(chǔ)上插入正向篩選標(biāo)記慶大霉素耐藥基因(GM)、反向篩選標(biāo)記蔗糖敏感基因(sacB)以及接合轉(zhuǎn)移基因(mob),構(gòu)建帶有同源片段的自殺性質(zhì)粒pGSM-△lasI和pGSM-△rhlI。通過接合轉(zhuǎn)移的方式將質(zhì)粒pGSM-△lasI轉(zhuǎn)入PA01可獲得lasI單突變菌株,將質(zhì)粒pGSM-△rhlI轉(zhuǎn)入PA01可獲得rhlI單突變菌株,再將pGSM-△lasI轉(zhuǎn)入rhlI單突變菌株中則可獲得雙突變菌株。 2.突變菌株的鑒定首先,設(shè)計(jì)lasI、rhlI基因的外引物,通過PCR對同源重組的菌株初篩并測序確定；其次,合成生物素標(biāo)記的探針,采用southern blot對lasI基因單突變的菌株實(shí)行進(jìn)一步確證；再次,建立高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC/MS)檢測HSL的方法,從基因表達(dá)方面來驗(yàn)證lasI、rhlI基因缺失后HSL信號分子分泌情況。 3.建立E.coli-PA接合反應(yīng)模型,研究HSL對接合反應(yīng)頻率的影響采用濾膜雜交法,E.coliSM10λ pir(pUCP24T)分別與PA01,PA-△lasI、 PA-△rhlI、PA-△lasIrhlI進(jìn)行接合反應(yīng),通過平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算接合反應(yīng)頻率。 結(jié)果： 1.構(gòu)建自殺性質(zhì)粒pGSM-△lasI,pGSM-△rhlI,lasI基因缺失菌株P(guān)A-△lasI,rhlI基因缺失菌株P(guān)A-△rhlI,以及l(fā)asI、rhlI雙缺失菌株P(guān)A-△lasIrhlI。并通過PCR及基因測序、Southern blot證實(shí)突變菌株構(gòu)建成功。 2.通過HPLC/MS檢測HSL,PA-△lasI菌株中未檢測到3-oxo-C12-HSL且C4-HSL也低于檢測限；PA-△rhlI菌株中檢測到3-oxo-C12-HSL正常產(chǎn)生且與PA01比較無差異(P0.05),但C4-HSL檢測不到；PA-△lasIrhlI菌株中3-oxo-C12-HSL與C4-HSL均檢測不到。3-oxo-C12-HSL在與C4-HSL在6h時(shí)開始檢測到,且隨著時(shí)間增加,C4-HSL的量逐漸增加,而3-oxo-C12-HSL則基本保持穩(wěn)定。加入2u g/mL阿奇霉素(AZM)后,3-oxo-C12-HSL與PA01組相較明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),C4-HSL量有減少趨勢但與PA01比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.在E.coli-PA接合反應(yīng)中,PA-△lasI、PA-△rhlI、PA-△lasIrhlI的接合反應(yīng)頻率較PA01組降低(P0.05)。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建lasI、rhlI基因單、雙突變菌株P(guān)A-△lasI、PA-△rhlI及PA-△lasIrhlI。 2.lasI基因位于rhlI基因的上游并對其有調(diào)控作用,當(dāng)lasI基因缺失突變后,菌株不僅不再合成3-oxo-C12-HSL,而且C4-HSL的量也明顯減少。rhl7基因缺失后,C4-HSL合成被阻斷,但3-oxo-C12-HSL的合成并未受影響。lasI、rhlI雙缺失后HSL信號分子在相應(yīng)基因缺失后分泌明顯減少。2u g/mL AZM能抑制HSL的分泌。 3.在PA-E.coli接合反應(yīng)中,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的突變菌株P(guān)A-△lasI.PA-△rhlI及PA-△lasIrhlI與PA01組比較,HSL信號分子量明顯減少,其接合反應(yīng)頻率也均降低,這可能是因?yàn)镠SL在PA的接合轉(zhuǎn)移中起了重要作用,但具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：銅綠假單胞菌 群體感應(yīng)系統(tǒng) 同源重組 高絲氨酸內(nèi)酯 自殺性質(zhì)粒 接合反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-10
• 目錄10-12
• 引言12-14
• 第一部分 載體及突變菌株構(gòu)建14-27
• 1.1 材料14-15
• 1.1.1 菌株14-15
• 1.1.2 主要培養(yǎng)基及抗生素15
• 1.1.3 主要試劑15
• 1.1.4 主要儀器15
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法15-24
• 1.2.1 構(gòu)建同源重組載體16-19
• 1.2.1.1 pGSM-△lasI載體(串聯(lián)lasI基因上下游片段自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建)16-18
• 1.2.1.2 pGSM-Arhll載體（串聯(lián)r/?7/基因上下游片段自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建）18-19
• 1.2.2 同源重組突變菌株的建立19-20
• 1.2.3 實(shí)驗(yàn)具體操作方法20-23
• 1.2.4 接合轉(zhuǎn)移23-24
• 1.3 結(jié)果24-25
• 1.3.1 載體pGSM-ΔlasI,pGSM-ΔrhlI的鑒定24
• 1.3.2 同源重組構(gòu)建突變菌株24-25
• 1.4 討論25-27
• 第二部分 突變菌株的鑒定27-38
• 2.1 材料27-28
• 2.1.1 Southern Blot所用試劑及配制方法27
• 2.1.2 HPLC/MS所需試劑及材料27-28
• 2.1.3 HPLC/MS主要儀器28
• 2.2 方法28-31
• 2.2.1 PCR鑒定及基因測序28
• 2.2.2 Souther Blot28-29
• 2.2.3 HPLC-MS(高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)檢測HSL29-31
• 2.3 結(jié)果31-36
• 2.3.1 PCR及基因測序?qū)ν蛔兙甑蔫b定31-32
• 2.3.2. Southern blot鑒定突變株P(guān)A-ΔlasI32-33
• 2.3.3 HPLC/MS檢測33-36
• 2.4 討論36-38
• 第三部分 lasI與rhlI基因缺失對接合反應(yīng)頻率的影響38-41
• 3.1 材料38
• 3.1.1 菌株與質(zhì)粒38
• 3.1.2 試劑及儀器38
• 3.2 方法38-39
• 3.2.1 PA生長曲線38
• 3.2.2 接合反應(yīng)38
• 3.2.3 統(tǒng)計(jì)方法38-39
• 3.3 結(jié)果39-40
• 3.3.1 PA01野生株及其lasI、rhlI基因單雙缺失菌株的生長曲線39
• 3.3.2 lasI與rhlI基因缺失對接合反應(yīng)頻率的影響39-40
• 3.4 討論40-41
• 結(jié)語41-42
• 參考文獻(xiàn)42-45
• 綜述45-52
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 附錄52-54
• 在校期間發(fā)表論文情況54-55
• 致謝55

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 陳茶;林冬玲;李有強(qiáng);張妮;袁慧;曾建明;張偉錚;黃彬;;多重耐藥銅綠假單胞菌分子流行病學(xué)的研究[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2011年21期

2 綦國紅;董明盛;王歲樓;;N-�；�-高絲氨酸內(nèi)酯類群體感應(yīng)信號分子檢測方法的建立[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2007年04期

3 徐操;李曼;黃媛媛;張哲;邊子睿;宋水山;;細(xì)菌群體感應(yīng)參與銅綠假單胞菌胞內(nèi)聚羥基脂肪酸酯合成的調(diào)控[J];微生物學(xué)報(bào);2011年06期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 沈繼錄;耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

2 陳一強(qiáng);綠原酸對銅綠假單胞菌生物膜抑制作用及其機(jī)制的體內(nèi)外研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2010年

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本文編號：762301