本文關(guān)鍵詞：人羊膜上皮細(xì)胞的干細(xì)胞特性及其在不同濃度維甲酸誘導(dǎo)下分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的研究

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【摘要】：目的：1.建立人羊膜上皮細(xì)胞(HAECs)的分離培養(yǎng)體系,對人羊膜上皮細(xì)胞進行分離、培養(yǎng)、鑒定、純化及擴增。2.探索人羊膜上皮細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞特性,研究其誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的潛能。3.探索維甲酸誘導(dǎo)人羊膜上皮細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的最優(yōu)濃度。方法：1.人羊膜清洗剪碎后先經(jīng)0.25%Ⅱ型膠原酶消化2小時,然后經(jīng)0.25%胰酶/0.02%EDTA消化15min后,將細(xì)胞懸液以1×107個/ml的密度接種到25ml培養(yǎng)瓶中,倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察細(xì)胞變化：免疫組化和免疫熒光方法鑒定貼壁細(xì)胞是否為人羊膜上皮細(xì)胞。2.采用免疫組化方法鑒定胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)記SSEA-4,0ct-4和神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記nestin和musashi在體外培養(yǎng)的人羊膜上皮細(xì)胞(HAECs)中的表達情況。3.實驗組使用不同濃度(1×10-8M、1×10-7M、1×10-6M、1×10-5M)的維甲酸在體外誘導(dǎo)人羊膜上皮細(xì)胞(HAECs),未加入維甲酸干預(yù)的為對照組。7天后,采用免疫組化、western-blotting、RT-PCR檢測細(xì)胞胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)記Oct-4、神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記nestin、神經(jīng)元特異性標(biāo)記MAP-2和膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記GFAP的表達情況,實驗結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。結(jié)果：1.倒置相差顯微鏡觀察到分離的細(xì)胞2-3天后貼壁,之后細(xì)胞逐漸變大,折光性降低,整個細(xì)胞輪廓變暗,完全伸展的細(xì)胞形態(tài)多樣,呈梭形、多角形、眼睛樣等,輪廓清晰,胞漿豐富,胞核呈圓形、卵圓形,核居中。3d后,人羊膜上皮細(xì)胞進入指數(shù)生長期,細(xì)胞數(shù)量明顯增多,呈不規(guī)則的多角形,5d-7d左右90%細(xì)胞融合成片,形成單層放射狀或漩渦狀生長。細(xì)胞免疫組化和免疫熒光顯示全部的貼壁細(xì)胞內(nèi)上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物CK19表達強陽性,而間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物vimentin僅在部分細(xì)胞內(nèi)弱陽性表達。2.體外培養(yǎng)的人羊膜上皮細(xì)胞內(nèi)胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)記SSEA-4, Oct-4和神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記nestin和musashi表達陽性3.細(xì)胞免疫組化、蛋白印跡技術(shù)和Real-time PCR結(jié)果免疫組化結(jié)果：與對照組相比,實驗組中胚胎干細(xì)胞標(biāo)記Oct-4表達降低,神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記nestin、神經(jīng)元特異性標(biāo)記MAP-2和膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記GFAP的表達升高；各實驗組相比較,隨著維甲酸濃度的升高,胚胎干細(xì)胞標(biāo)記Oct-4表達逐漸降低,神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記nestin、神經(jīng)元特異性標(biāo)記MAP-2和膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記GFAP的表達逐漸升高。實驗組中加入10-5M的維甲酸誘導(dǎo)后細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡樣改變,大量細(xì)胞固縮脫落,并可見部分細(xì)胞碎片。蛋白印跡結(jié)果：隨著維甲酸濃度增高,Nestin, MAP-2和GFAP在蛋白水平表達逐漸增高,而OCT-4蛋白表達逐漸降低。與對照組比較,實驗組nestin蛋白、MAP-2蛋白和GFAP蛋白表達均明顯增加,并有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。實驗組中1×10-7M較1×10-8 M nestin蛋白、MAP-2蛋白和GFAP蛋白表達增多,且有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)；1×10-6M較1×10-7 Mnestin蛋白、MAP-2蛋白和GFAP蛋白表達增多,且有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)；1×10-5M較1×10-6M nestin蛋白、MAP-2蛋白和GFAP蛋白表達增多,但無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。與對照組比較,實驗組Oct-4蛋白表達均明顯降低,且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。實驗組中1×10-7M較1×10-8 M Oct-4蛋白表達降低,且有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)；1×10-6M較1×10-7 MOct-4蛋白表達降低,且有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)；1×10-5M較1×10-6 M Oct-4蛋白表達降低,但無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。Real-time PCR結(jié)果：與對照組比較,實驗組nestin mRNA、MAP-2 mRNA和GFAP mRNA表達均明顯增加,并有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。實驗組中1×10-7M較1×10-8 Mnestin mRNA、MAP-2 mRNA和GFAP mRNA表達增多,且有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)：1×10-6 M較1 × 10-7 M nestin mRNA,MAP-2 mRNA和GFAP mRNA表達增多,且有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)；1×10-5M較1×10-6M nestin mRNA、MAP-2 mRNA和GFAP mRNA表達增多,但無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。與對照組比較,實驗組Oct-4 mRNA表達均明顯降低,且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),實驗組中1×10-7 M較1×10-8 M Oct-4 mRNA表達降低,且有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)；1×106-M較1×10-7 M Oct-4 mRNA表達降低,且有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)：1×10-5M較1×10-6 M Oct-4 mRNA表達降低,但無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。結(jié)論：1.體外成功完成人羊膜上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定、純化和擴增。2.人羊膜上皮細(xì)胞能夠表達胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志,具有胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞特性,并可能具有向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的潛能。3.人羊膜上皮細(xì)胞能夠被維甲酸誘導(dǎo)為神經(jīng)樣細(xì)胞,維甲酸濃度與誘導(dǎo)分化程度呈劑量依賴關(guān)系,1×10-5M的維甲酸使人羊膜上皮細(xì)胞死亡細(xì)胞比例明顯升高,1×10-6M的維甲酸濃度是誘導(dǎo)人羊膜上皮細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的最適宜濃度。
【關(guān)鍵詞】：人羊膜上皮細(xì)胞 干細(xì)胞 維甲酸 細(xì)胞治療 誘導(dǎo)分化
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 前言10-13
• 第一部分：人羊膜上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定13-21
• 一、主要實驗材料13-14
• 二、實驗方法14-16
• 三、結(jié)果16-17
• 四、討論17-18
• 五、結(jié)論18-19
• 附圖19-21
• 第二部分：人羊膜上皮細(xì)胞生物學(xué)特性的鑒定21-25
• 一、主要材料與儀器21
• 二、實驗方法21
• 三、實驗結(jié)果21
• 四、討論21-23
• 五、結(jié)論23-24
• 附圖24-25
• 第三部分：人羊膜上皮細(xì)胞經(jīng)不同濃度維甲酸誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的實驗研究25-39
• 一、主要實驗材z125-27
• 二、實驗方法27-29
• 三、結(jié)果29-30
• 四、討論30-32
• 五、結(jié)論32-33
• 附圖33-39
• 參考文獻39-41
• 綜述41-46
• 參考文獻44-46
• 致謝46-47

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