發(fā)布時(shí)間：2017-08-28 22:22

  本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)節(jié)苷脂GD2在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離和鑒定研究中的應(yīng)用

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【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs),也稱為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,是骨髓中的一種成體干細(xì)胞,占骨髓來(lái)源單核細(xì)胞群的比例不到0.01%。一直以來(lái)由于沒(méi)有找到理想的用于鑒定BM-MSCs的特異性標(biāo)志,通常采用多種表面分子聯(lián)合鑒定體外培養(yǎng)的BM-MSCs。最近一種新發(fā)現(xiàn)的表面分子神經(jīng)節(jié)苷脂GD2,被用來(lái)鑒定人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)等間充質(zhì)干細(xì)胞。但大鼠BM-MSCs是否表達(dá)GD2還未見(jiàn)報(bào)道,本試驗(yàn)研究了大鼠BM-MSCs的GD2表達(dá)情況,為探索特異性分離、準(zhǔn)確鑒定大鼠BM-MSCs提供新的技術(shù)途徑；實(shí)驗(yàn)還應(yīng)用percoll密度梯度離心法對(duì)大鼠BM-MSCs的分離方法進(jìn)行了優(yōu)化,都為獲得可用于移植的高純度BM-MSCs建立了技術(shù)平臺(tái)。 實(shí)驗(yàn)一大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂GD2的實(shí)驗(yàn)研究 研究方法：(1) BM-MSCs的分離和體外純化培養(yǎng)：運(yùn)用全骨髓貼壁法分離8-10周齡SD大鼠BM-MSCs,以1×109個(gè)/ml接種于含15%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)基,37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)GD2合成酶mRNA表達(dá)的檢測(cè)：以大鼠胚胎成纖維細(xì)胞(REFs)和小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16F10)分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照,應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)第一代、第三代和第五代BM-MSCs的GD2合成酶mRNA表達(dá)情況。(3)BM-MSCs膜表面GD2的檢測(cè)：應(yīng)用細(xì)胞免疫組化法,檢測(cè)第一代、第三代和第五代BM-MSCs表面GD2的表達(dá)。(4) BM-MSCs表面分子CD3、CD29、CD45、CD90表達(dá)的檢測(cè)：應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第一代、第三代和第五代BM-MSCs表面分子群(CD3、CD2、CD45、CD90)的表達(dá),對(duì)BM-MSCs表面分子群的表達(dá)結(jié)果與表面分子GD2流式檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。 結(jié)果：(1)BM-MSCs的培養(yǎng)與傳代：全骨髓貼壁法培養(yǎng)BM-MSCs從原代培養(yǎng)到傳代培養(yǎng)周期很長(zhǎng),需8-10d方可傳代,以后傳代培養(yǎng)周期縮短,每三天即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。(2) BM-MSCs GD2合成酶mRNA的表達(dá)：原代細(xì)胞中GD2合成酶mRNA表達(dá)較低,隨著傳一、二、三代,細(xì)胞內(nèi)GD2合成酶mRNA表達(dá)量隨之增加,之后再進(jìn)行傳代培養(yǎng)顯示GD2合成酶mRNA表達(dá)處在一個(gè)穩(wěn)定水平。REFs陰性表達(dá)GD2合成酶mRNA, B16F10陽(yáng)性表達(dá)GD2合成酶mRNA。(3) BM-MSCs膜表面GD2分子表達(dá)：細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示在第一代、第三代和第五代BM-MSCs的膜表面均表達(dá)GD2。(4) BM-MSCs表面分子群的表達(dá)：以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BM-MSCs的表面分子群,CD90陽(yáng)性細(xì)胞比率,第一、三、五代分別為59.2%、87.1%、98.2%；CD29陽(yáng)性細(xì)胞比率,第一、三、五代分別為69%、80.9%、99.9%；CD45陽(yáng)性細(xì)胞比率,第一、三、五代分別為13.8%、5.1%、1.1%；CD3陽(yáng)性細(xì)胞比率,第一、三代分別為4.4%、0.8%；GD2陽(yáng)性細(xì)胞比率,第-三、五、七代分別為87.3%、48.2%、36.2%、18.9%。 結(jié)論：(1)全骨髓貼壁法能成功分離培養(yǎng)大鼠BM-MSCs,體外培養(yǎng)的原代BM-MSCs和傳一代、三代、五代的細(xì)胞內(nèi)均表達(dá)GD2合成酶mRNA和膜表面GD2,與人和小鼠的研究結(jié)果一致,提示GD2種屬間的保守性很高。(2)隨著體外傳代培養(yǎng),細(xì)胞內(nèi)GD2合成酶mRNA表達(dá)量呈遞增變化而流式檢測(cè)細(xì)胞表面分子GD2陽(yáng)性細(xì)胞比率呈遞減變化,GD2合成酶是GD2生物合成過(guò)程中的一種限速酶,由于BM-MSCs從體內(nèi)到體外環(huán)境的改變,GD2合成酶在mRNA水平表達(dá)量增高并沒(méi)有提高膜表面GD2分子陽(yáng)性細(xì)胞比率其具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。(3)體外傳代培養(yǎng)大鼠BM-MSCs過(guò)程中,膜表面分子GD2陽(yáng)性細(xì)胞比率呈遞減變化,說(shuō)明體外培養(yǎng)的BM-MSCs表面分子GD2的表達(dá)逐漸減少,與文獻(xiàn)報(bào)道的GD2可以作為鑒定人和小鼠早期MSCs的特異性標(biāo)志一致。(4)隨著傳代純化培養(yǎng)的進(jìn)行,通常用于聯(lián)合鑒定的表面分子CD90、CD45陽(yáng)性細(xì)胞比率呈遞增變化,到第五代時(shí)CD90、CD45雙陽(yáng)性細(xì)胞比率達(dá)98%,細(xì)胞純度高,可用于后續(xù)試驗(yàn)研究。 實(shí)驗(yàn)二應(yīng)用神經(jīng)節(jié)苷脂GD2分離和鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 研究方法：(1)采用Percoll密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BM-MSCs, RT-PCR檢測(cè)不同密度梯度層細(xì)胞(1.0448g/ml、1.0578g/ml、1.0708g/ml、1.0838g/ml、1.0968g/ml)GD2合成酶mRNA的表達(dá),確定BM-MSCs所處的密度層,為快速獲得BM-MSCs提供依據(jù)。(2)對(duì)密度梯度離心法分離獲得的BM-MSCs進(jìn)行體外培養(yǎng),觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)特性,采用四甲基噻嘩藍(lán)(MTT)比色試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力,繪制生長(zhǎng)曲線,并與全骨髓貼壁法培養(yǎng)的細(xì)胞活力進(jìn)行比較。(3)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)密度梯度離心分離得到的BM-MSCs表面分子群(CD3、CD29、CD45、CD90)的表達(dá),檢測(cè)其純度。 結(jié)果：(1)RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果顯示,僅在1.0708g/ml這一密度層的細(xì)胞有GD2合成酶mRNA的表達(dá)。(2)密度梯度離心得到的細(xì)胞接種后,剛開(kāi)始增殖慢,適應(yīng)一段時(shí)間后,經(jīng)6-7d原代培養(yǎng)后即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),傳代培養(yǎng)的周期為2-3d,與全骨髓貼壁法傳代培養(yǎng)的周期相近。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)傳代后的細(xì)胞活力較高,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞在接種后15h左右。(3)密度梯度離心獲得的細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng),流式細(xì)胞檢測(cè)一代細(xì)胞表面分子CD90、CD29、CD45、CD3陽(yáng)性細(xì)胞比率分別為88.5%、99.9%、0.2%、0.1%,其純度高于全骨髓貼壁法獲得的一代細(xì)胞。 結(jié)論：Percoll密度梯度離心法能夠快速獲得BM-MSCs,離心過(guò)程中細(xì)胞受到一定損傷,接種培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)貼壁所需的時(shí)間較貼壁分離法長(zhǎng),一般原代培養(yǎng)6-7d可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代后的細(xì)胞活力增高,增殖快；流式細(xì)胞檢測(cè)密度梯度獲得的傳一代BM-MSCs表面分子群CD3、CD29、CD45、CD90陽(yáng)性細(xì)胞比率比全骨髓貼壁法獲得的一代細(xì)胞的純度高。傳一代后細(xì)胞形態(tài)趨于一致,采用MTT比色檢測(cè)密度梯度離心獲得的一代、二代、三代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞活力,繪制生長(zhǎng)曲線,與全骨髓貼壁法培養(yǎng)的一代、二代、三代細(xì)胞進(jìn)行比較。密度梯度離心得到的細(xì)胞活力高于全骨髓貼壁法,且密度梯度離心培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在接種后的15h左右,相比貼壁細(xì)胞的24h,其增殖周期縮短,細(xì)胞活力高。
【關(guān)鍵詞】：大鼠 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂 鑒定 密度梯度離心
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• ABSTRACT6-9
• 目錄9-10
• 符號(hào)說(shuō)明10-11
• 文獻(xiàn)綜述11-26
• 1. 神經(jīng)節(jié)苷脂11-16
• 1.1 神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)構(gòu)和分布11
• 1.2 神經(jīng)節(jié)苷脂的生物學(xué)功能11-12
• 1.3 神經(jīng)節(jié)苷脂在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中的作用12-13
• 1.4 神經(jīng)節(jié)苷脂與神經(jīng)疾病13
• 1.5 神經(jīng)節(jié)苷脂與腫瘤疾病13-14
• 1.6 神經(jīng)節(jié)苷脂是一些神經(jīng)細(xì)胞特有標(biāo)記物14-15
• 1.7 GD2的生物學(xué)特性15-16
• 2. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞16-20
• 2.1 BM-MSCs概述16
• 2.2 BM-MSCs的形態(tài)特征16-17
• 2.3 BM-MSCs的分化潛能17-18
• 2.4 BM-MSCs的分離和培養(yǎng)18
• 2.5 BM-MSCs的鑒定18-20
• 參考文獻(xiàn)20-26
• 研究論文26-55
• 第一章 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂GD2的研究26-48
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料26-29
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法29-35
• 3. 結(jié)果35-46
• 4. 討論46-48
• 第二章 應(yīng)用神經(jīng)節(jié)苷脂GD2分離鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞48-55
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料48
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法48-50
• 3. 結(jié)果50-53
• 4. 討論53-55
• 全文結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-58
• 致謝58-59
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄59-60

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 邱麗燕,王金福;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];生物工程學(xué)報(bào);2003年02期

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本文編號(hào)：749802