發(fā)布時間：2017-08-28 03:03

  本文關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌Dnaj蛋白質(zhì)的初步晶體學(xué)和功能研究

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【摘要】：背景肺炎鏈球菌是一種條件致病菌，已成為社區(qū)感染的重要病原菌之一。Dnaj屬于肺炎鏈球菌的熱休克蛋白40（HSP40）家族成員，在蛋白的折疊、轉(zhuǎn)運等過程中扮演著重要的角色。該蛋白的活性位點及其作用機制，可以為我們尋找新的抗肺炎鏈球菌藥物提供重要的信息。目前，肺炎鏈球菌的Dnaj蛋白的三維結(jié)構(gòu)還沒得到解析，其活性位點和作用機制仍然不清楚。 目的解析肺炎鏈球菌Dnaj蛋白的三維結(jié)構(gòu)，找出其活性位點，通過功能實驗，，了解其作用機制，為開發(fā)新型抗肺炎鏈球菌藥物奠定基礎(chǔ)。 方法將SpDnaj基因重組到PET28a載體上，構(gòu)建PET28a-dnaj質(zhì)粒，用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達該蛋白，通過金屬離子親和層析柱（Ni-NAT）、陰離子交換層析柱（DEAE Sepharose Fast Flow）進行純化，得到目的蛋白。用分子篩（Superdex200）分析蛋白在溶液中的聚集狀態(tài)。用甲硫氨酸缺陷大腸桿菌Ecoli. B834表達硒代SpDnaj蛋白。坐滴氣相擴散法和懸滴氣相擴散法相結(jié)合，培養(yǎng)母體蛋白質(zhì)和硒代蛋白質(zhì)的晶體，X-射線衍射儀收集晶體衍射數(shù)據(jù)，再分別采用分子置換和多波長反常散射法解析晶體三維結(jié)構(gòu)。根據(jù)三維結(jié)構(gòu)選擇蛋白定點突變的位點，再用等溫滴定量熱法（Isothermal Titration Calorimetry,ITC）和表面等離子體共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)突變尋找蛋白與底物的結(jié)合位點，通過進一步的功能實驗明確其活性位點和作用機制。 結(jié)果成功構(gòu)建重組質(zhì)粒PET28a-Dnaj，表達、純化出純度約85%的Dnaj蛋白質(zhì)，該蛋白以四聚體形式存在于溶液中。表達、純化出硒代Dnaj蛋白質(zhì)。培養(yǎng)出晶型好、偏光能力強的母體蛋白質(zhì)單晶、硒代蛋白質(zhì)單晶以及SpDnaj和多肽P5-10復(fù)合物的晶體。在上海同步輻射光源收到母體、硒代蛋白質(zhì)和復(fù)合物晶體的衍射數(shù)據(jù)以供解析結(jié)構(gòu)使用。SpDnaj晶體屬于空間群I222或I2_12_12_1，晶胞參數(shù)為a=47.68、b=104.45、c=234.57。根據(jù)SpDnaJ的分子量(約40kDa)和空間群，溶劑含量分析表明，每個晶體學(xué)不對稱單位（per asymmetric unit）含一個蛋白質(zhì)分子，提示一個V_M值3.24A~3Da~(-1)，對應(yīng)的容積含量為62.08%。但是，分子置換和多波長反常散射方法都沒能成功解析出蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。ITC和SPR結(jié)果提示SpDnaj與多肽P5-10有結(jié)合。
【關(guān)鍵詞】：肺炎鏈球菌 Dnaj 晶體 蛋白質(zhì)肽復(fù)合物 三維結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.12
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 第一章 肺炎鏈球菌 Dnaj 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究13-41
• 前言13-16
• 第一節(jié) 肺炎鏈球菌 Dnaj 蛋白的克隆、表達和純化16-29
• 1 材料與方法16-25
• 2 結(jié)果25-28
• 3 討論28-29
• 第二節(jié) 肺炎鏈球菌 Dnaj 的初步晶體學(xué)研究29-35
• 1 材料和方法29-31
• 2 結(jié)果31-33
• 3 討論33-35
• 第三節(jié) 肺炎鏈球菌 Dnaj 功能的研究35-38
• 1 材料與方法35-37
• 2 結(jié)果37-38
• 3 討論38
• 參考文獻38-41
• 第二章 肺炎鏈球菌甘油脫氫酶的結(jié)構(gòu)和功能研究41-53
• 第一節(jié) 肺炎鏈球菌 GldA 蛋白質(zhì)的克隆、表達和純化42-47
• 1 材料和方法42-44
• 2 結(jié)果44-46
• 3 討論46-47
• 第二節(jié) 肺炎鏈球菌 GldA 的初步晶體學(xué)分析47-49
• 1 材料和方法47
• 2 結(jié)果47-48
• 3 討論48-49
• 第三節(jié) 肺炎鏈球菌 GldA 的功能研究49-51
• 1.材料與方法49
• 2 結(jié)果49-50
• 3 討論50-51
• 參考文獻51-53
• 全文總結(jié)53-55
• 文獻綜述55-61
• 參考文獻58-61
• 致謝61-62
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及學(xué)術(shù)會議62-63

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

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2 符運良;傅軍;吳英才;袁一方;;表面等離子共振傳感技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用[J];激光雜志;2006年06期

本文編號：747058