本文關鍵詞：石杉堿甲對D-半乳糖衰老大鼠肝臟細胞凋亡與自體吞噬的作用機制研究

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【摘要】：[背景] 隨著人們生活水平的提高,人口老齡化逐漸加速,已成為當今社會面臨的重要挑戰(zhàn)。因此,對衰老機制及衰老相關疾病的研究越發(fā)重要,近年來得到廣泛的重視和關注。目前衰老的確切機制尚不清楚。D-半乳糖可誘導機體氧化應激損傷,模擬自然衰老進程,是目前衰老研究常用的動物模型。石杉堿甲是一種可逆的、選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEI),目前國內臨床廣泛應用于神經(jīng)退行性疾病的治療,如阿爾茨海默病。然而,關于石杉堿甲能否改善D-半乳糖所致的肝臟衰老及其在衰老肝臟細胞凋亡與自體吞噬中的作用,目前尚未見研究。血管內皮生長因子(VEGF)是機體重要的細胞因子,可通過血管內皮生長因子受體-2(VEGFR-2/Flk-1),調節(jié)下游的PI3K/Akt/GSK-3β信號通路,參與細胞凋亡的調控。同時,PI3K/Akt/mTOR信號通路與自體吞噬密切相關,GSK-3p亦可參與調節(jié)mTOR活性。細胞凋亡與自體吞噬兩條信號通路可被這些共同的因子調控,這使兩者之間存在密切聯(lián)系。因此,我們設想：石杉堿甲能通過Flk-1調節(jié)下游的PI3K/Akt/GSK-3β/mTOR信號通路,參與調節(jié)D-半乳糖大鼠肝臟的細胞凋亡與自體吞噬,進而保護肝臟,延緩衰老。 [目的] 1.建立D-半乳糖大鼠衰老模型,通過血清肝功能、肝臟免疫組織化學染色及電鏡檢測,評估D-半乳糖能否誘導肝臟損傷及衰老。在此基礎上,進一步探討石杉堿甲對D-半乳糖所致肝臟損傷及衰老的作用。 2.比較各組肝臟凋亡指數(shù)(AI)及caspase3表達,探討石杉堿甲對衰老大鼠肝臟細胞凋亡的影響。同時比較各組肝臟Flk-1(A-3)、p-Flk-1(tyr996)-R、 p-GSK-3p(Ser9)表達水平,進一步探討石杉堿甲能否通過Flk-1/Akt/GSK-3β信號通路調節(jié)肝臟細胞凋亡。 3.比較各組肝臟p-mTOR(S2448)、LC3B、Atg7的表達,探討石杉堿甲對衰老大鼠肝臟自體吞噬的影響。綜合分析肝臟p-GSK-3β(Ser9)、p-mTOR(S2448)表達情況,進一步探討石杉堿甲對衰老肝臟自體吞噬調節(jié)的可能機制。 [方法] 1.2月齡清潔級雄性Sprague Dawley大鼠36只,按隨機數(shù)字表法平均分為三組：(1)D-半乳糖組(D-半乳糖300mg/Kg/d皮下注射)；(2)D-半乳糖+石杉堿甲組(D-半乳糖300mg/Kg/d+石杉堿甲0.1mg/Kg/d聯(lián)合皮下注射)；(3)對照組(生理鹽水皮下注射)。每組各12只大鼠,實驗時間持續(xù)8周。第8周末,每組各取3只大鼠,進行BrdU標記。 2.留取血清,全自動生化分析儀測定肝酶指標,評估肝功能。免疫組織化學染色測定肝臟SA-β-Gal、BrdU表達,比較三組肝臟衰老情況。電鏡下觀察三組肝臟細胞顯微結構。 3. TUNEL染色檢測肝臟細胞凋亡情況,計算三組AI,統(tǒng)計學比較差異。免疫組織化學染色測定肝臟Flk-1(A-3)、p-Flk-1(tyr996)-R、p-GSK-3β(Ser9)表達,Western、Blot分析測定肝臟caspase3表達,利用圖像分析軟件對結果進行半定量測定,三組計量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學比較分析。 4.免疫組織化學染色測定肝臟p-mTOR(S2448)、LC3B、Atg7表達,Western Blot分析測定肝臟p-mTOR(S2448)表達,利用圖像分析軟件進行半定量分析,三組計量數(shù)據(jù)行統(tǒng)計學比較。 [結果] 1.2月齡雄性SD大鼠皮下注射D-半乳糖8周后,血清AST、TBIL、DBIL及ALP水平顯著高于對照組(AST、DBIL:P＜0.01；TBIL、ALP:P0.001)。石杉堿甲可有效抑制D-半乳糖導致的AST、TBIL升高(P0.05),而對ALP、DBIL作用不明顯。同時,與對照組相比,D-半乳糖+石杉堿甲組的AST、TBIL及ALP水平仍較高(AST、ALP:P0.05、TBIL:P0.01)。三組間ALT水平無明顯差異(F=0.0227,P=0.978)。這提示,石杉堿甲可一定程度上減輕D-半乳糖所致肝損傷,但不能完全逆轉。 2.免疫組織化學染色顯示,與對照組相比,D-半乳糖組肝臟SA-β-Gal表達明顯增加,BrdU陽性細胞顯著減少。D-半乳糖+石杉堿甲組SA-β-Gal表達情況與對照組相似,較D-半乳糖組明顯降低；BrdU陽性細胞較D-半乳糖組明顯增多,但仍低于對照組。這說明,D-半乳糖可導致肝細胞衰老及復制能力降低,石杉堿甲干預可有效改善。 3.電鏡顯示,D-半乳糖組有大量脂滴沉積,線粒體腫脹、嵴減少,溶酶體內見脂褐素沉積,支持肝臟存在衰老相關變化。D-半乳糖+石杉堿甲組腫脹線粒體、脂滴明顯減少,并見大量粗面內質網(wǎng),提示石杉堿甲有助于清除受損線粒體及脂滴,促進細胞合成功能,延緩衰老。 4. TUNEL染色顯示,D-半乳糖組見滿視野凋亡細胞(核棕黃色、碎片、皺縮),石杉堿甲干預后凋亡細胞明顯減少,對照組僅有少量凋亡細胞。D-半乳糖組AI(%)為73.150±2.635,明顯高于對照組(2.117±0.651)及D-半乳糖+石杉堿甲組(13.884±1.547),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。D-半乳糖+石杉堿甲組AI仍高于對照組(P0.05)。Western Blot分析顯示,D-半乳糖組肝臟caspase3表達明顯高于對照組(P0.001)。石杉堿甲干預可有效抑制caspase3表達(P0.01),但仍高于對照組(P0.01)。這說明,石杉堿甲可改善D-半乳糖所致的細胞凋亡,但尚不能完全逆轉。 5.免疫組織化學染色顯示,D-半乳糖+石杉堿甲組Flk-1(A-3)、p-Flk-1(tyr996)-R表達明顯高于其他兩組(P0.05),而對照組與D-半乳糖組之間沒有統(tǒng)計學差異(Flk-1(A-3):P=0.999; p-Flk-1(tyr996)-R:P=0.122)。p-GSK-3p(Ser9)的表達在三組間有明顯差異(ANOVA, F=1026.676, P0.001),其中以D-半乳糖+石杉堿甲組表達最高,對照組表達居中,D-半乳糖組表達最低(Holm-Sidak兩兩比較,P0.001)。這提示,石杉堿甲對衰老肝臟細胞凋亡的抑制,可能與Flk-1/Akt/GSK-3p信號通路的調節(jié)作用有關。 6.免疫組織化學染色顯示,D-半乳糖組肝臟p-mTOR(S2448)表達明顯高于對照組(P0.01)；D-半乳糖+石杉堿甲組表達較D-半乳糖組明顯下降(P0.05),與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P=0.731)。三組LC3B表達有顯著差異(ANOVA,F=38.4,P0.001)。D-半乳糖組LC3B表達低于對照組(P0.001)及D-半乳糖+石杉堿甲組(P0.01),石杉堿甲干預可促進LC3B表達,但仍低于對照組(P0.01)。三組Atg7表達無統(tǒng)計學差異(ANOVA, F=2.747, P=0.117),但平均光密度值顯示對照組Atg7表達相對最高,而D-半乳糖組最低。Western Blot分析顯示,D-半乳糖組肝臟p-mTOR(S2448)表達明顯高于對照組(P0.001)。石杉堿甲干預可有效抑制p-mTOR(S2448)表達(P0.01),但仍高于對照組(P0.01)。可見,D-半乳糖可抑制衰老肝臟的自體吞噬,石杉堿甲可一定程度上逆轉該作用,促進自體吞噬。 7.綜合分析三組肝臟p-GSK-3p(Ser9)及p-mTOR(S2448)表達情況,推斷石杉堿甲對mTOR信號通路及自體吞噬的調節(jié)過程很復雜,不僅僅通過Flk-1/Akt/GSK-3p通路進行,可能與其他信號通路相關,且這些調節(jié)通路共同作用,最終表現(xiàn)為對自體吞噬的促進。 [結論] 1.D-半乳糖皮下注射SD大鼠8周,可誘導肝臟損傷、肝細胞衰老及復制能力降低。石杉堿甲干預可減輕D-半乳糖所致的肝臟損傷,延緩衰老。 2.D-半乳糖可促進衰老肝臟的細胞凋亡,石杉堿甲干預可有效改善細胞凋亡,但不能完全逆轉。 3.石杉堿甲可能通過Flk-1/Akt/GSK-3p信號通路,參與調控衰老肝臟細胞凋亡 4.D-半乳糖可抑制衰老肝臟的自體吞噬,石杉堿甲干預可一定程度上逆轉該作用,促進自體吞噬。 5.石杉堿甲有助于清除衰老肝臟細胞內的受損線粒體及脂滴,促進細胞合成功能,這可能與其促進自體吞噬的作用有關。 6.石杉堿甲對mTOR信號通路及自體吞噬的調節(jié)過程很復雜,可能不僅僅通過Flk-1/Akt/GSK-3p通路進行,還與其他信號通路相關。
【關鍵詞】：衰老 石杉堿甲 細胞凋亡 自體吞噬 VEGFR-2/Flk-1 GSK-3β mTOR
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R339.38
【目錄】：

• 英文縮寫詞索引4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-15
• 前言15-17
• 第一部分 D-半乳糖大鼠衰老模型的建立17-25
• 材料與方法17-20
• 結果20-23
• 討論23-25
• 第二部分 石杉堿甲與衰老肝臟細胞凋亡及自體吞噬關系的實驗研究25-43
• 材料與方法25-30
• 結果30-38
• 討論38-43
• 結論43-44
• 參考文獻44-50
• 附錄一 綜述50-59
• 參考文獻55-59
• 附錄二 碩士研究生在讀期間發(fā)表論文59-60
• 致謝60-61

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：744853