本文關(guān)鍵詞：石杉堿甲對D-半乳糖衰老大鼠肝臟細(xì)胞凋亡與自體吞噬的作用機(jī)制研究

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【摘要】：[背景] 隨著人們生活水平的提高,人口老齡化逐漸加速,已成為當(dāng)今社會面臨的重要挑戰(zhàn)。因此,對衰老機(jī)制及衰老相關(guān)疾病的研究越發(fā)重要,近年來得到廣泛的重視和關(guān)注。目前衰老的確切機(jī)制尚不清楚。D-半乳糖可誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激損傷,模擬自然衰老進(jìn)程,是目前衰老研究常用的動物模型。石杉堿甲是一種可逆的、選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEI),目前國內(nèi)臨床廣泛應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的治療,如阿爾茨海默病。然而,關(guān)于石杉堿甲能否改善D-半乳糖所致的肝臟衰老及其在衰老肝臟細(xì)胞凋亡與自體吞噬中的作用,目前尚未見研究。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是機(jī)體重要的細(xì)胞因子,可通過血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2/Flk-1),調(diào)節(jié)下游的PI3K/Akt/GSK-3β信號通路,參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。同時,PI3K/Akt/mTOR信號通路與自體吞噬密切相關(guān),GSK-3p亦可參與調(diào)節(jié)mTOR活性。細(xì)胞凋亡與自體吞噬兩條信號通路可被這些共同的因子調(diào)控,這使兩者之間存在密切聯(lián)系。因此,我們設(shè)想：石杉堿甲能通過Flk-1調(diào)節(jié)下游的PI3K/Akt/GSK-3β/mTOR信號通路,參與調(diào)節(jié)D-半乳糖大鼠肝臟的細(xì)胞凋亡與自體吞噬,進(jìn)而保護(hù)肝臟,延緩衰老。 [目的] 1.建立D-半乳糖大鼠衰老模型,通過血清肝功能、肝臟免疫組織化學(xué)染色及電鏡檢測,評估D-半乳糖能否誘導(dǎo)肝臟損傷及衰老。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討石杉堿甲對D-半乳糖所致肝臟損傷及衰老的作用。 2.比較各組肝臟凋亡指數(shù)(AI)及caspase3表達(dá),探討石杉堿甲對衰老大鼠肝臟細(xì)胞凋亡的影響。同時比較各組肝臟Flk-1(A-3)、p-Flk-1(tyr996)-R、 p-GSK-3p(Ser9)表達(dá)水平,進(jìn)一步探討石杉堿甲能否通過Flk-1/Akt/GSK-3β信號通路調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞凋亡。 3.比較各組肝臟p-mTOR(S2448)、LC3B、Atg7的表達(dá),探討石杉堿甲對衰老大鼠肝臟自體吞噬的影響。綜合分析肝臟p-GSK-3β(Ser9)、p-mTOR(S2448)表達(dá)情況,進(jìn)一步探討石杉堿甲對衰老肝臟自體吞噬調(diào)節(jié)的可能機(jī)制。 [方法] 1.2月齡清潔級雄性Sprague Dawley大鼠36只,按隨機(jī)數(shù)字表法平均分為三組：(1)D-半乳糖組(D-半乳糖300mg/Kg/d皮下注射)；(2)D-半乳糖+石杉堿甲組(D-半乳糖300mg/Kg/d+石杉堿甲0.1mg/Kg/d聯(lián)合皮下注射)；(3)對照組(生理鹽水皮下注射)。每組各12只大鼠,實驗時間持續(xù)8周。第8周末,每組各取3只大鼠,進(jìn)行BrdU標(biāo)記。 2.留取血清,全自動生化分析儀測定肝酶指標(biāo),評估肝功能。免疫組織化學(xué)染色測定肝臟SA-β-Gal、BrdU表達(dá),比較三組肝臟衰老情況。電鏡下觀察三組肝臟細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)。 3. TUNEL染色檢測肝臟細(xì)胞凋亡情況,計算三組AI,統(tǒng)計學(xué)比較差異。免疫組織化學(xué)染色測定肝臟Flk-1(A-3)、p-Flk-1(tyr996)-R、p-GSK-3β(Ser9)表達(dá),Western、Blot分析測定肝臟caspase3表達(dá),利用圖像分析軟件對結(jié)果進(jìn)行半定量測定,三組計量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較分析。 4.免疫組織化學(xué)染色測定肝臟p-mTOR(S2448)、LC3B、Atg7表達(dá),Western Blot分析測定肝臟p-mTOR(S2448)表達(dá),利用圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析,三組計量數(shù)據(jù)行統(tǒng)計學(xué)比較。 [結(jié)果] 1.2月齡雄性SD大鼠皮下注射D-半乳糖8周后,血清AST、TBIL、DBIL及ALP水平顯著高于對照組(AST、DBIL:P＜0.01；TBIL、ALP:P0.001)。石杉堿甲可有效抑制D-半乳糖導(dǎo)致的AST、TBIL升高(P0.05),而對ALP、DBIL作用不明顯。同時,與對照組相比,D-半乳糖+石杉堿甲組的AST、TBIL及ALP水平仍較高(AST、ALP:P0.05、TBIL:P0.01)。三組間ALT水平無明顯差異(F=0.0227,P=0.978)。這提示,石杉堿甲可一定程度上減輕D-半乳糖所致肝損傷,但不能完全逆轉(zhuǎn)。 2.免疫組織化學(xué)染色顯示,與對照組相比,D-半乳糖組肝臟SA-β-Gal表達(dá)明顯增加,BrdU陽性細(xì)胞顯著減少。D-半乳糖+石杉堿甲組SA-β-Gal表達(dá)情況與對照組相似,較D-半乳糖組明顯降低；BrdU陽性細(xì)胞較D-半乳糖組明顯增多,但仍低于對照組。這說明,D-半乳糖可導(dǎo)致肝細(xì)胞衰老及復(fù)制能力降低,石杉堿甲干預(yù)可有效改善。 3.電鏡顯示,D-半乳糖組有大量脂滴沉積,線粒體腫脹、嵴減少,溶酶體內(nèi)見脂褐素沉積,支持肝臟存在衰老相關(guān)變化。D-半乳糖+石杉堿甲組腫脹線粒體、脂滴明顯減少,并見大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),提示石杉堿甲有助于清除受損線粒體及脂滴,促進(jìn)細(xì)胞合成功能,延緩衰老。 4. TUNEL染色顯示,D-半乳糖組見滿視野凋亡細(xì)胞(核棕黃色、碎片、皺縮),石杉堿甲干預(yù)后凋亡細(xì)胞明顯減少,對照組僅有少量凋亡細(xì)胞。D-半乳糖組AI(%)為73.150±2.635,明顯高于對照組(2.117±0.651)及D-半乳糖+石杉堿甲組(13.884±1.547),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。D-半乳糖+石杉堿甲組AI仍高于對照組(P0.05)。Western Blot分析顯示,D-半乳糖組肝臟caspase3表達(dá)明顯高于對照組(P0.001)。石杉堿甲干預(yù)可有效抑制caspase3表達(dá)(P0.01),但仍高于對照組(P0.01)。這說明,石杉堿甲可改善D-半乳糖所致的細(xì)胞凋亡,但尚不能完全逆轉(zhuǎn)。 5.免疫組織化學(xué)染色顯示,D-半乳糖+石杉堿甲組Flk-1(A-3)、p-Flk-1(tyr996)-R表達(dá)明顯高于其他兩組(P0.05),而對照組與D-半乳糖組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(Flk-1(A-3):P=0.999; p-Flk-1(tyr996)-R:P=0.122)。p-GSK-3p(Ser9)的表達(dá)在三組間有明顯差異(ANOVA, F=1026.676, P0.001),其中以D-半乳糖+石杉堿甲組表達(dá)最高,對照組表達(dá)居中,D-半乳糖組表達(dá)最低(Holm-Sidak兩兩比較,P0.001)。這提示,石杉堿甲對衰老肝臟細(xì)胞凋亡的抑制,可能與Flk-1/Akt/GSK-3p信號通路的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。 6.免疫組織化學(xué)染色顯示,D-半乳糖組肝臟p-mTOR(S2448)表達(dá)明顯高于對照組(P0.01)；D-半乳糖+石杉堿甲組表達(dá)較D-半乳糖組明顯下降(P0.05),與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.731)。三組LC3B表達(dá)有顯著差異(ANOVA,F=38.4,P0.001)。D-半乳糖組LC3B表達(dá)低于對照組(P0.001)及D-半乳糖+石杉堿甲組(P0.01),石杉堿甲干預(yù)可促進(jìn)LC3B表達(dá),但仍低于對照組(P0.01)。三組Atg7表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(ANOVA, F=2.747, P=0.117),但平均光密度值顯示對照組Atg7表達(dá)相對最高,而D-半乳糖組最低。Western Blot分析顯示,D-半乳糖組肝臟p-mTOR(S2448)表達(dá)明顯高于對照組(P0.001)。石杉堿甲干預(yù)可有效抑制p-mTOR(S2448)表達(dá)(P0.01),但仍高于對照組(P0.01)。可見,D-半乳糖可抑制衰老肝臟的自體吞噬,石杉堿甲可一定程度上逆轉(zhuǎn)該作用,促進(jìn)自體吞噬。 7.綜合分析三組肝臟p-GSK-3p(Ser9)及p-mTOR(S2448)表達(dá)情況,推斷石杉堿甲對mTOR信號通路及自體吞噬的調(diào)節(jié)過程很復(fù)雜,不僅僅通過Flk-1/Akt/GSK-3p通路進(jìn)行,可能與其他信號通路相關(guān),且這些調(diào)節(jié)通路共同作用,最終表現(xiàn)為對自體吞噬的促進(jìn)。 [結(jié)論] 1.D-半乳糖皮下注射SD大鼠8周,可誘導(dǎo)肝臟損傷、肝細(xì)胞衰老及復(fù)制能力降低。石杉堿甲干預(yù)可減輕D-半乳糖所致的肝臟損傷,延緩衰老。 2.D-半乳糖可促進(jìn)衰老肝臟的細(xì)胞凋亡,石杉堿甲干預(yù)可有效改善細(xì)胞凋亡,但不能完全逆轉(zhuǎn)。 3.石杉堿甲可能通過Flk-1/Akt/GSK-3p信號通路,參與調(diào)控衰老肝臟細(xì)胞凋亡 4.D-半乳糖可抑制衰老肝臟的自體吞噬,石杉堿甲干預(yù)可一定程度上逆轉(zhuǎn)該作用,促進(jìn)自體吞噬。 5.石杉堿甲有助于清除衰老肝臟細(xì)胞內(nèi)的受損線粒體及脂滴,促進(jìn)細(xì)胞合成功能,這可能與其促進(jìn)自體吞噬的作用有關(guān)。 6.石杉堿甲對mTOR信號通路及自體吞噬的調(diào)節(jié)過程很復(fù)雜,可能不僅僅通過Flk-1/Akt/GSK-3p通路進(jìn)行,還與其他信號通路相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：衰老 石杉堿甲 細(xì)胞凋亡 自體吞噬 VEGFR-2/Flk-1 GSK-3β mTOR
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R339.38
【目錄】：

• 英文縮寫詞索引4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-15
• 前言15-17
• 第一部分 D-半乳糖大鼠衰老模型的建立17-25
• 材料與方法17-20
• 結(jié)果20-23
• 討論23-25
• 第二部分 石杉堿甲與衰老肝臟細(xì)胞凋亡及自體吞噬關(guān)系的實驗研究25-43
• 材料與方法25-30
• 結(jié)果30-38
• 討論38-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-50
• 附錄一 綜述50-59
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 附錄二 碩士研究生在讀期間發(fā)表論文59-60
• 致謝60-61

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 黃忠獻(xiàn);金訊波;王慕文;張沂南;鄭懿;夏慶華;;丙戊酸對前列腺癌PC3細(xì)胞自噬的影響[J];山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2011年07期

2 Juan M Esteve;Erwin Knecht;;Mechanisms of autophagy and apoptosis:Recent developments in breast cancer cells[J];World Journal of Biological Chemistry;2011年10期

3 張志才;邵增務(wù);熊蠡茗;車彪;鄧超;楊述華;;順鉑誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞自噬及其與凋亡關(guān)系的體外研究[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2011年02期

4 Yanhui Lu;Xiaodong Yuan;Qiaoyu Sun;Ya Ou;;Autophagy activator promotes neuronal differentiation of adult adipose-derived stromal cells[J];Neural Regeneration Research;2013年10期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 胡占英;張靖溥;孟杰;佟軍威;秦偉;;斑馬魚自噬途徑與帕金森病的相關(guān)性[A];2011年中國藥學(xué)大會暨第11屆中國藥師周論文集[C];2011年

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本文編號：744853