本文關(guān)鍵詞：H5N1禽流感病毒HA基因在原核系統(tǒng)的表達(dá)及其活性檢測(cè)

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【摘要】：流感病毒屬于RNA病毒的正黏病毒科,分甲、乙、丙3個(gè)型；其中禽流感病毒(vian Influenza Virus, AIV)屬于甲型,一般僅感染禽類；如果病毒在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生基因重配,致使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,則獲得感染人的能力,從而使得人被感染禽流感。到目前為止,能直接感染人的禽流感病毒亞型有：H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2和H7N9等。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),在眾多人感染禽流感病毒的亞型中,H5N1的致死率最高。1997年,中國(guó)香港一名死于流感的3歲男孩體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)并分離出能直接感染人類的禽流感病毒亞型H5N1。截止到2013年,全球共報(bào)告人感染高致病性H5N1禽流感622例,其中死亡371例；病例主要分布于15個(gè)國(guó)家,其中我國(guó)發(fā)現(xiàn)45例,死亡30例。目前研究普遍認(rèn)為：1.H5N1的傳染源為攜帶病毒的禽類；2.H5N1的傳播途徑主要包括禽—人傳播、禽排泄物污染的環(huán)境—人傳播、少數(shù)非持續(xù)人—人傳播。鑒于H5N1的高致病性及對(duì)全球人類健康影響重大,本文主要針對(duì)H5N1展開(kāi)相關(guān)研究[5]。 H5N1病毒顆粒外膜由兩種表面糖蛋白覆蓋,一種為植物血凝素(Hemagglutinin, HA),另一型為神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase protein, NA),HA分15個(gè)亞型,NA分9個(gè)亞型。HA約含550個(gè)氨基酸,以同源三聚體形式存在于H5N1病毒表面,能與呼吸道相關(guān)細(xì)胞表面唾液酸受體特異性結(jié)合,在介導(dǎo)病毒吸附、穿膜以及刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體等方面起到重要作用；此外,HA的可裂解性是H5N1亞型禽流感病毒組織嗜性的關(guān)鍵因素,因?yàn)橹挥蠬A前體被宿主細(xì)胞的蛋白酶裂解后,流感病毒才具有感染性。因此,HA的這兩大特殊性質(zhì)決定了其在H5N1高致病性及在疾病的診斷和防治技術(shù)研究的重要地位。NA則可清除呼吸道上皮細(xì)胞表面的唾液酸,協(xié)助HA使禽流感病毒得以侵入上皮細(xì)胞。 密碼子是mRNA鏈上決定一個(gè)氨基酸的相鄰三個(gè)堿基,與基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。外源基因mRNA密碼子構(gòu)成決定著外源基因在宿主中表達(dá)量。真核系統(tǒng)和原核系統(tǒng)偏愛(ài)的密碼子不同,當(dāng)我們用原核系統(tǒng)表達(dá)真核基因時(shí),真核基因中的部分密碼子對(duì)于原核系統(tǒng)來(lái)說(shuō)可能是稀有密碼子,導(dǎo)致外源基因表達(dá)效率和表達(dá)水平很低。有研究通過(guò)對(duì)H5N1亞型AIV的HA基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn),HA完整ORF序列中含有大量稀有密碼子,且部分稀有密碼子相距很近,甚至出現(xiàn)相鄰并列的情況,這些均不利于HA在大腸桿菌中的成功表達(dá)。但有研究表明,一種稱為Rosetta菌株通�？捎行岣吆写罅肯∮忻艽a子的目的基因表達(dá)。Rosetta宿主菌是BL21衍生菌,能明顯增強(qiáng)攜帶大量大腸桿菌稀有密碼子的真核基因的表達(dá)；該菌株通過(guò)一個(gè)相容性氯霉素抗性質(zhì)粒補(bǔ)充密碼子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs[11];這樣Rosetta菌株實(shí)現(xiàn)了“萬(wàn)能”的翻譯。故本研究由采用該菌株來(lái)表達(dá)HA基因,從而克服了HA蛋白不易提純、產(chǎn)量低、價(jià)格昂貴等問(wèn)題,為我們深入研究H5N1亞型AIV提供支持。 本研究根據(jù)GenBank上公布的H5N1亞型禽流感病毒的HA基因序列設(shè)計(jì)引物(HA基因來(lái)自北京軍事科學(xué)醫(yī)學(xué)院提供的pcDNA3.1-H5N1-HA),運(yùn)用PCR方法擴(kuò)增H5N1亞型禽流感病毒HA基因。用Xho I和BamH I雙酶切后,獲得全長(zhǎng)HA基因,將HA基因分別與酶切的pET-32a(+)連接,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a (+)-HA,經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌Rosetta. Gami B(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),運(yùn)用SDS-PAGE方法鑒定表達(dá)蛋白,發(fā)現(xiàn)HA基因獲得大量表達(dá),重組HA蛋白以包涵體的形式存在。 液相芯片,又稱為微球體懸浮芯片(suspension array, liquid chip),是基于xMAP (flexible Multi Analyte Profiling)技術(shù)的新型生物芯片技術(shù),具有高通量、靈活快速、精確、重復(fù)性好、操作方便等眾多優(yōu)點(diǎn),可用于蛋白質(zhì)和核酸等生物分子高通量的檢測(cè)。液相芯片技術(shù)基本原理是在不同熒光編碼的微球上進(jìn)行抗原-抗體、酶-底物、配體-受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng),通過(guò)紅、綠兩束激光分別檢測(cè)微球編碼和報(bào)告熒光信號(hào)來(lái)達(dá)到定性和定量的目的,通常一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以完成近100多種不同生物學(xué)反應(yīng)。 熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, qPCR)[14]是一種基于普通PCR技術(shù)創(chuàng)建的一種通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量的方法。它的作用機(jī)制為在PCR進(jìn)程中,隨著產(chǎn)物的積累,熒光信號(hào)的強(qiáng)度等比加強(qiáng),根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化即可監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化。該項(xiàng)技術(shù)最大特點(diǎn)為特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、快速高效。qPCR技術(shù)應(yīng)用范圍極為廣泛,其中包括mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性的測(cè)定等；同時(shí)它也可以廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué),如針對(duì)常見(jiàn)病原體定量檢測(cè),從而做到早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用qPCR來(lái)檢測(cè)IP-10在mRNA水平的表達(dá)情況。 細(xì)胞因子是細(xì)胞應(yīng)對(duì)各類刺激而分泌的小分子蛋白,可介導(dǎo)并調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化、組織的發(fā)育與修復(fù)等多種生命過(guò)程,同時(shí)在人體對(duì)疾病的免疫調(diào)節(jié)、炎癥應(yīng)答、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程中起著重要的作用。細(xì)胞因子的改變與疾病特異性損害的程度相關(guān),因此,在評(píng)價(jià)一些疾病活動(dòng)程度中顯得非常重要。綜上,本研究運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)來(lái)檢測(cè)HA蛋白刺激正常人支氣管上皮細(xì)胞(Human bronchial epithelial cells,16HBE)后細(xì)胞上清中細(xì)胞因子及趨化因子的變化,進(jìn)而鑒定出HA蛋白生物活性。 近來(lái)研究認(rèn)為,體內(nèi)病毒載量過(guò)高及過(guò)度的炎癥反應(yīng)造成免疫病理?yè)p傷是AIV主要的致病機(jī)制。AIV通過(guò)其表面膜蛋白-血凝素(Hemagglutinin protein,HA)與呼吸道上皮細(xì)胞如正常人支氣管上皮細(xì)胞的相應(yīng)受體結(jié)合而感染侵入細(xì)胞,這一過(guò)程誘導(dǎo)了細(xì)胞因子及趨化因子的大量釋放,進(jìn)而活化并募集巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞至感染部位,導(dǎo)致嚴(yán)重的彌漫性肺泡損傷,引起一個(gè)類似急性呼吸窘迫綜合癥的病理生理改變以及繼發(fā)的全身多器官免疫炎癥性反應(yīng)。然而迄今為止,缺乏針對(duì)這種免疫損傷的特效治療藥物,為此本研究試圖在接受HA蛋白刺激后的16HBE所分泌的各種細(xì)胞因子及趨化因子中找出影響H5N1亞型AIV高致病性的相關(guān)細(xì)胞因子及趨化因子,進(jìn)而探索出一種通過(guò)抑制相關(guān)細(xì)胞因子的分泌達(dá)到降低H5N1亞型AIV高致病性的新途徑。 通過(guò)以上研究,我們得出以下結(jié)果： (1)通過(guò)酶切和測(cè)序鑒定,證明成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-HA。 (2)運(yùn)用氯化鈣法成功制備了Rosetta.gami B(DE3)菌株感受態(tài)。 (3)pET-32a(+)-HA轉(zhuǎn)化到Rosetta.gami B(DE3)菌株中,IPTG誘導(dǎo)下產(chǎn)生的蛋白大小在66.0kDa-90.0kED之間,篩選pET-32a(+)-HA(DE3)大量誘導(dǎo)的最佳表達(dá)條件為,誘導(dǎo)溫度25℃,IPTG終濃度為0.5mM,誘導(dǎo)時(shí)間為2h、4h、8h、過(guò)夜,通過(guò)SDS-PAGE電泳分析,IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)HA ORF目的蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯影響。 (4)發(fā)現(xiàn)重組HA蛋白以包涵體的形式存在,通過(guò)SDS-PAGE電泳分析,誘導(dǎo)表達(dá)菌體超聲波沉淀物在66.0kDa-90.0kDa之間處出現(xiàn)大量與預(yù)期目的一致的表達(dá)產(chǎn)物堆積,而上清及未誘導(dǎo)對(duì)照在該位置未發(fā)現(xiàn)有目的表達(dá)產(chǎn)物出現(xiàn)。 (5)通過(guò)使用變性增溶劑,加能促進(jìn)蛋白質(zhì)打開(kāi)二硫鍵的二硫蘇糖醇(DTT),使包涵體蛋白變?yōu)榭扇苄缘鞍?從而方便表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA純化柱得到純化蛋白,SDS-PAGE分離蛋白復(fù)合物的電泳結(jié)果顯示,純化HA蛋白中非特異性的蛋白較少。 (6)利用液相芯片技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞上清中細(xì)胞因子及趨化因子的變化,結(jié)果顯示,HA蛋白刺激正常人支氣管上皮細(xì)胞,在16HBE細(xì)胞培養(yǎng)的上清中IL-6、IL-8、GM-CSF與對(duì)照組比較表達(dá)明顯升高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (7)不同濃度梯度的重組HA蛋白刺激16HBE細(xì)胞2h后,提取總RNA,運(yùn)用熒光定量PCR(Realtime-PCR)檢測(cè)IP-10基因的表達(dá)。 綜上所述,本研究首先成功地構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-HA,再次通過(guò)生物信息學(xué)分析人的HA基因編碼區(qū)含有大量影響蛋白表達(dá)的大腸桿菌稀有密碼子,因此選擇了對(duì)稀有密碼子表達(dá)效應(yīng)較好的菌株Rossetta(DE3)。該實(shí)驗(yàn)成功地將HA基因的全編碼區(qū)克隆進(jìn)表達(dá)載體并通過(guò)優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了HA基因在大腸桿菌中的表達(dá),運(yùn)用SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)的目的蛋白相對(duì)分子量與預(yù)期相符合,且非特異性蛋白較少,利用液相芯片技術(shù)檢測(cè)接受HA蛋白刺激的16HBE細(xì)胞上清中細(xì)胞因子及趨化因子的變化,進(jìn)而鑒定重組蛋白的生物活性。這不僅為進(jìn)一步研究禽流感病毒HA蛋白的性質(zhì)、致病機(jī)制等方面的研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),而且也為深入研究人感染高致病性禽流感的發(fā)病機(jī)制及其防治策略提供了新的機(jī)遇。
【關(guān)鍵詞】：H5N1禽流感病毒 HA蛋白 原核系統(tǒng) Rossetta菌株 液相芯片檢測(cè) 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373.13;R3416
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-18
• 第一章 前言18-25
• 1.1 禽流感病毒概況18-19
• 1.2 禽流感病毒血凝素結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及功能19-21
• 1.3 禽流感病毒防治現(xiàn)狀21-22
• 1.4 本課題研究思路及意義22-25
• 第二章 材料與方法25-48
• 2.1 材料25-30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法30-48
• 第三章 結(jié)果48-57
• 3.1 HA蛋白原核表達(dá)載體PET-32A(+)-HA的構(gòu)建及純化48-54
• 3.2 重組HA蛋白的生物活性檢測(cè)54-57
• 第四章 討論57-68
• 4.1 H5N1亞型禽流感的臨床表現(xiàn)57
• 4.2 H5N1亞型禽流感的防治措施57-59
• 4.3 HA蛋白生物學(xué)功能說(shuō)明59
• 4.4 PET-32A(+)-HA重組質(zhì)粒構(gòu)建59-61
• 4.5 原核表達(dá)宿主菌的選擇61-62
• 4.6 大腸桿菌感受態(tài)制備62-63
• 4.7 蛋白最佳表達(dá)條件篩選63-64
• 4.8 包涵體蛋白變性及復(fù)性64-65
• 4.9 HA蛋白活性檢測(cè)65-68
• 參考文獻(xiàn)68-77
• 中英文縮略詞對(duì)照表77-79
• 在讀碩士期間發(fā)表的論文79-80
• 致謝80-82

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王瀟娣;朱玲;蔡雨函;黃仆;徐志文;;豬NF-κB p65/p50亞基的原核表達(dá)及其對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖的影響[J];病毒學(xué)報(bào);2013年06期

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本文編號(hào)：738607