本文關(guān)鍵詞：HLA-A2限制性survivin點突變抗原肽特異性TCR基因篩選及抗腫瘤功能驗證

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【摘要】：目的：通過HLA-A2限制性survivin點突變抗原肽（Sur79M2）體外刺激T淋巴細胞，，篩選特異性識別Sur79M2的TCR基因。構(gòu)建TCR基因雙表達載體，包裝重組嵌合型腺病毒并轉(zhuǎn)染T淋巴細胞，研究轉(zhuǎn)Sur79M2特異性TCR基因T細胞的抗腫瘤功能，為今后點突變腫瘤相關(guān)抗原（TAA）的特異性T細胞過繼性腫瘤治療新方法和新型靶點TCR基因治療藥物奠定基礎。 方法： 一.分離HLA-A2+健康人外周血單個核細胞（PBMC），體外誘導DC細胞，成熟DC細胞負載Sur79M2與T淋巴細胞共培養(yǎng)，對照組DC未負載Sur79M2與T淋巴細胞共培養(yǎng)。流式細胞術(shù)檢測T細胞抗原受體（TCR）Vβ亞家族表達譜。 二.多重基因分析系統(tǒng)Gexp檢測Sur79M2刺激的實驗組及對照組T細胞抗原受體（TCR）Vα和Vβ亞家族表達格局。 三.提取實驗組RNA，克隆Sur79M2特異性TCRVα和Vβ基因，構(gòu)建重組嵌合型腺病毒穿梭質(zhì)粒p315TCRVα-IRES-Vβ。 四.通過Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將腺病毒骨架質(zhì)粒與構(gòu)建的腺病毒穿梭質(zhì)粒p315TCR Vα-IRES-Vβ共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，包裝表達目的基因的重組腺病毒。獲得的初病毒提取病毒基因組DNA，PCR擴增目的基因及腺病毒骨架質(zhì)粒纖毛基因進行鑒定。病毒轉(zhuǎn)染淋巴細胞，檢測目的基因的轉(zhuǎn)染效率。將鑒定正確的重組嵌合型腺病毒大量擴增，過濾TCID50法測病毒滴度。 五.腺病毒轉(zhuǎn)染PBMC36小時后，分別作T2細胞負載Sur79M2（HLA-A2+、Survivin+）、肝癌細胞株HepG2（HLA-A2+、Survivin+）、乳腺癌細胞株Mcf-7（HLA-A2+、Survivin+）、肝癌細胞株7402（HLA-A2-、Survivin+）及肺癌細胞株NCI-H1299（HLA-A2-、Survivin-），12h、24h、36h三個時間點MTT檢測殺傷效果及Elisa法檢測IFN-γ的分泌。 結(jié)果：經(jīng)DC負載Sur79M2刺激的PBMC流式檢測TCRVβ亞家族表達情況發(fā)現(xiàn)TCRVβ7.1亞家族表達明顯升高，而Gexp檢測TCRVα和Vβ基因表達顯示TCRVα4和Vβ7基因出現(xiàn)單一主峰的寡克隆峰圖。克隆TCRVα4和Vβ7基因后測序分析CDR3序列證實TCRVα4和Vβ7基因發(fā)生了克隆增殖現(xiàn)象。構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒p315-TCRVα4-IRES-Vβ7，包裝重組嵌合型腺病毒，并從病毒中擴增出目的基因。重組嵌合型腺病毒轉(zhuǎn)染淋巴細胞后流式檢測能有效檢測到目的基因的表達。MTT法檢測殺傷效率依次為T2負載肽 HepG2（HLA-A2+、Survivin+） Mcf-7（HLA-A2+、Survivin+）7402（HLA-A2-、Survivin+） NCI-H1299（HLA-A2-、Survivin-），IFN-γ的分泌情況幾乎與MTT殺傷效率一致。 結(jié)論：通過DC負載Sur79M2體外刺激T淋巴細胞的方法，成功篩選到Sur79M2特異性TCRVα4和Vβ7基因�？寺√禺愋訲CRVα4和Vβ7基因并成功構(gòu)建了重組嵌合型腺病毒穿梭質(zhì)粒p315-TCRVα4-IRES-Vβ7。體外抗腫瘤功能研究中Sur79M2特異性TCRVα4和Vβ7基因顯示出有效識別及殺傷負載了Sur79M2T2細胞的能力，而且對于表達野生型survivin抗原的腫瘤細胞株也具有一定的活化殺傷功能。
【關(guān)鍵詞】：survivin TCR Vα4 TCR Vβ7 重組嵌合型腺病毒 HLA-A2
【學位授予單位】：廣東藥學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-15
• 第一部分 SUR79M2 體外刺激健康人外周血單個核細胞及流式檢測 TCRVΒ亞家族表達譜15-23
• 引言15
• 1.1 材料15-16
• 1.1.1 樣本15
• 1.1.2 試劑15
• 1.1.3 儀器15-16
• 1.2 方法16-18
• 1.2.1 實驗樣本采集16
• 1.2.2 健康人外周血白膜 HLA 分型檢測16-17
• 1.2.3 健康人外周血白膜淋巴細胞的分離17
• 1.2.4 DC 細胞的誘導17
• 1.2.5 DC 細胞表型分析17-18
• 1.2.6 DC 細胞負載 Sur79M2 并刺激 T 淋巴細胞18
• 1.2.7 流式細胞儀檢測體外 Sur79M2 刺激后 T 淋巴細胞中 TCRVβ亞家族表達情況18
• 1.3 結(jié)果18-22
• 1.3.1 流式檢測健康人白膜樣本 HLA 型別18-19
• 1.3.2 DC 細胞形態(tài)學觀察19-20
• 1.3.3 流式檢測成熟細胞表型20-21
• 1.3.4 流式細胞儀檢測體外 Sur79M2 刺激后 T 淋巴細胞中 TCRVβ亞家族表達情況21-22
• 1.4 小結(jié)22-23
• 第二部分 GEXP 檢測 TCRVΑ、Β鏈基因表達情況23-32
• 引言23
• 2.1 材料23
• 2.1.1 試劑23
• 2.1.2 儀器23
• 2.2 方法23-27
• 2.2.1 Gexp 檢測體外 Sur79M2 刺激后 T 淋巴細胞中 TCRVα、β鏈基因表達情況23-27
• 2.3 結(jié)果27-31
• 2.3.1 Gexp 檢測體外 Sur79M2 刺激后 T 淋巴細胞中 TCRVα、β鏈基因表達情況27-31
• 2.4 小結(jié)31-32
• 第三部分 TCRVΑ4、VΒ7 基因克隆及 P315-TCRVΑ4-IRES-VΒ7 雙表達穿梭載體構(gòu)建32-45
• 引言32
• 3.1 材料32
• 3.1.1. 質(zhì)粒、菌株、試劑32
• 3.1.2 儀器32
• 3.2 方法32-39
• 3.2.1 獲得 TCRVα4、Vβ7 基因32-34
• 3.2.2 膠回收 PCR 產(chǎn)物連接 T 載體34-35
• 3.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提取35-36
• 3.2.4 構(gòu)建 p315-TCRva4-IRES-vb7 雙表達穿梭載體36-39
• 3.3 結(jié)果39-44
• 3.3.1 獲取 TCRVα4 、Vβ7 基因39
• 3.3.2 TCRVα4 、Vβ7 基因連接 T 載體測序結(jié)果39-41
• 3.3.3 構(gòu)建 p315-TCRVα4-IRES-Vβ7 雙表達穿梭載體結(jié)果41-44
• 3.4 小結(jié)44-45
• 第四部分 重組嵌合型腺病毒 AD5/F35 的包裝、鑒定以及滴度測定45-51
• 引言45
• 4.1 材料45
• 4.1.1 質(zhì)粒、細胞和試劑45
• 4.1.2 儀器45
• 4.2 方法45-48
• 4.2.1 重組嵌合型腺病毒 Ad5/F35. p315-TCRVα4-IRES-Vβ7 的包裝45-46
• 4.2.2 重組嵌合型腺病毒鑒定46-48
• 4.3 結(jié)果48-50
• 4.3.1 HEK-293 細胞包裝腺病毒48
• 4.3.2 重組嵌合型腺病毒 Ad5/F35. TCR Vβ 7 的 PCR 鑒定48-49
• 4.3.3 重組嵌合型腺病毒 Ad5/F35.p315-TCR Vα4-IRES-TCR Vβ7 流式鑒定49-50
• 4.3.4 重組嵌合型腺病毒 Ad5/F35 p315-TCRVα4-IRES-Vβ7 擴大培養(yǎng)50
• 4.4 小結(jié)50-51
• 第五部分 SUR79M2 優(yōu)勢取用基因 TCR VΑ4、VΒ7 重組腺病毒抗瘤譜51-59
• 引言51
• 5.1 材料51
• 5.1.1 細胞、試劑51
• 5.1.2 儀器51
• 5.2 方法51-53
• 5.2.1 檢測腫瘤細胞株中 HLA 分型及 survivin 表達情況51-52
• 5.2.2 MTT 比色法檢測 survivin 抗原肽優(yōu)勢取用基因 TCR Vα4、Vβ7 重組腺病毒對腫瘤細胞的殺傷效果52-53
• 5.2.3 Elisa 試劑盒檢測 IFN-γ的釋放53
• 5.3 結(jié)果53-57
• 5.3.1 腫瘤細胞株中 HLA 分型及 survivin 表達情況53-55
• 5.3.2 MTT 比色法檢測 Sur79M2 優(yōu)勢取用基因 TCRva4、vb7 重組腺病毒對腫瘤細胞的殺傷效果55-56
• 5.3.3 IFN-γ的釋放檢測結(jié)果56-57
• 5.4 小結(jié)57-59
• 討論59-64
• 參考文獻64-70
• 附錄一 英文縮略詞表70-71
• 附錄二 質(zhì)粒圖譜71-74
• 附錄三 引物列表74-76
• 附錄四 攻讀學位期間發(fā)表的論文76-77
• 致謝77

【參考文獻】

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本文編號：735170