本文關鍵詞：豬螺桿菌聚合酶鏈反應檢測方法的建立及初步應用

  更多相關文章： 豬螺桿菌 實時熒光定量-聚合酶鏈反應 幽門螺桿菌 蛋白表達 支原體

【摘要】：本課題研究除包括“豬螺桿菌PCR檢測方法的建立及初步應用”外,還根據(jù)課題組的安排,進行了“幽門螺桿菌重要蛋白的原核表達和純化”和“艾滋病相關支原體多重實時熒光聚合酶鏈反應檢測方法的初步建立”兩項研究,主要內容如下： 第一部分：豬螺桿菌PCR檢測方法的建立及初步應用 豬螺桿菌(Helicobacter suis,簡稱H.suis)是一種微需氧的革蘭氏陰性菌,是最常見的非幽門螺桿菌的螺桿菌(NHPH).它存在于60%的屠宰豬胃中,與豬慢性胃炎和潰瘍相關。人類可能通過與感染的動物接觸或污染的食物而感染H.suis, H.suis也與人類的慢性胃炎和潰瘍疾病相關。 本研究選取來自中國3個地區(qū)的420份快速尿素酶檢測陽性胃黏膜標本(來自重慶市第三軍醫(yī)大學附屬大坪醫(yī)院、安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院、北京軍區(qū)總醫(yī)院和北京大學第三醫(yī)院),采用基于H.suis尿素酶基因特異引物的聚合酶鏈反應(PCR)檢測方法,對它們的H.suis感染狀況進行了實驗室檢測和分析。利用H.suis尿素酶基因特異引物從標本核酸中擴增出相應的目的片段,與已知序列比對結果同源性接近100%,說明人群中存在H.suis的感染。結果共檢測到26份陽性標本,H.suis的陽性檢測率達6.2%,且感染率可能存在地域和人群差異(0-7.7%),首次提供了我國內鏡受檢人群尿素酶檢測陽性胃黏膜標本的H.suis陽性率,為進一步H.suis的分離培養(yǎng)及相關疾病的防治提供了重要信息。 實驗中,使用Beacon Designer7.0軟件在H.suis gryB和ure B基因保守區(qū)域設計引物及熒光探針,建立并優(yōu)化實時熒光定量-聚合酶鏈反應(real-time)檢測體系,并對體系的特異度和靈敏度進行評價。建立了一種快速、準確的H.suis real-time PCR檢測方法,其檢測靈敏度比普通PCR高且耗時較短,為以后開展相關檢測和分析奠定基礎。 第二部分：幽門螺桿菌重要蛋白的原核表達和純化 幽門螺桿菌Helicobacter pylori,簡稱H.pylori)也是一種微需氧的革蘭氏陰性菌,為慢性活動性胃炎、消化性潰瘍的主要病原菌,并與胃癌和胃粘膜相關性淋巴組織淋巴瘤(MALT)的發(fā)生密切相關,被列為I類致癌因子。目前,H. pylori感染導致胃癌的致病機制仍不明確。 本研究選取與H. pylori感染導致胃癌發(fā)生密切相關的3種蛋白,通過蛋白生物信息學如信號肽、二級結構等系列分析、引物設計、聚合酶鏈反應(PCR)擴增、連接構建pET28a(+)表達載體后,通過轉化大腸桿菌BL21(DE3)后誘導表達并進行純化,獲得大量預期大小的表達蛋白,該蛋白經(jīng)質譜鑒定與實驗設計目標蛋白氨基酸序列100%同源。本研究成功構建了3種幽門螺桿菌的重組原核表達質粒,且研究中獲得的純化蛋白可以為進一步的蛋白功能研究及H.pylori致病機制研究提供一定的前期基礎。 第三部分：艾滋病相關支原體多重實時熒光聚合酶鏈反應檢測方法的初步建立 穿透支原體(Mycoplasma penetrans, Mpe)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans, Mf)和梨支原體(Mycoplasma pirum, Mpi)是近年來新發(fā)現(xiàn)的艾滋病相關支原體,國外研究表明,這3種支原體是艾滋病感染的協(xié)同因子和發(fā)病的誘發(fā)因素。本研究的目的是建立一種快速、靈敏和特異的艾滋病相關支原體多重實時熒光聚合酶鏈反應(Multiplex real-time PCR)檢測技術。使用Beacon Desigener7.0軟件在穿透支原體和發(fā)酵支原體的ftsZ基因以及梨支原體的rpoB基因保守區(qū)域設計多重引物和熒光探針,建立并優(yōu)化艾滋病相關支原體Multiplex real-time PCR檢測體系。分別使用3種支原體陽性質粒標準品評價體系的靈敏度,使用8種其他支原體、14種常見致病菌和人類基因組核酸評價該體系的特異度,并與普通聚合酶鏈反應(PCR)檢測方法進行比較。該Multiplex real-time PCR方法對穿透支原體和發(fā)酵支原體檢測靈敏度為103拷貝,約為普通PCR的10倍,對梨支原體檢測靈敏度為102拷貝,約為普通PCR的100倍。該體系對8種其他支原體、14種常見致病菌和人類基因組均不能擴增。本研究建立的Multiplex real-time PCR方法可同時快速、準確地檢測穿透支原體、發(fā)酵支原體和梨支原體。有望用于臨床標本檢測,完善對艾滋病相關支原體的檢測能力。
【關鍵詞】：豬螺桿菌 實時熒光定量-聚合酶鏈反應 幽門螺桿菌 蛋白表達 支原體
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378
【目錄】：

• 主要英文縮略語索引5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 第一部分 豬螺桿菌PCR檢測方法的建立及初步應用11-32
• 前言11-14
• 材料與方法14-21
• 一、材料14-16
• 二、方法16-21
• 結果21-30
• 討論30-31
• 小結31-32
• 第二部分 幽門螺桿菌重要蛋白的原核表達和純化32-56
• 前言32-33
• 材料與方法33-47
• 一、材料33-40
• 二、方法40-47
• 結果47-54
• 討論54-55
• 小結55-56
• 第三部分 艾滋病相關支原體多重實時熒光聚合酶鏈反應檢測方法的初步建立56-63
• 前言56-57
• 材料與方法57-59
• 結果59-62
• 討論62-63
• 參考文獻63-70
• 綜述70-75
• 參考文獻72-75
• 發(fā)表論文75-76
• 致謝76

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：723896