發(fā)布時(shí)間：2017-08-23 08:06

  本文關(guān)鍵詞：豬螺桿菌聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

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【摘要】：本課題研究除包括“豬螺桿菌PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用”外,還根據(jù)課題組的安排,進(jìn)行了“幽門螺桿菌重要蛋白的原核表達(dá)和純化”和“艾滋病相關(guān)支原體多重實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法的初步建立”兩項(xiàng)研究,主要內(nèi)容如下： 第一部分：豬螺桿菌PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用 豬螺桿菌(Helicobacter suis,簡(jiǎn)稱H.suis)是一種微需氧的革蘭氏陰性菌,是最常見(jiàn)的非幽門螺桿菌的螺桿菌(NHPH).它存在于60%的屠宰豬胃中,與豬慢性胃炎和潰瘍相關(guān)。人類可能通過(guò)與感染的動(dòng)物接觸或污染的食物而感染H.suis, H.suis也與人類的慢性胃炎和潰瘍疾病相關(guān)。 本研究選取來(lái)自中國(guó)3個(gè)地區(qū)的420份快速尿素酶檢測(cè)陽(yáng)性胃黏膜標(biāo)本(來(lái)自重慶市第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院、安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、北京軍區(qū)總醫(yī)院和北京大學(xué)第三醫(yī)院),采用基于H.suis尿素酶基因特異引物的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)方法,對(duì)它們的H.suis感染狀況進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和分析。利用H.suis尿素酶基因特異引物從標(biāo)本核酸中擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段,與已知序列比對(duì)結(jié)果同源性接近100%,說(shuō)明人群中存在H.suis的感染。結(jié)果共檢測(cè)到26份陽(yáng)性標(biāo)本,H.suis的陽(yáng)性檢測(cè)率達(dá)6.2%,且感染率可能存在地域和人群差異(0-7.7%),首次提供了我國(guó)內(nèi)鏡受檢人群尿素酶檢測(cè)陽(yáng)性胃黏膜標(biāo)本的H.suis陽(yáng)性率,為進(jìn)一步H.suis的分離培養(yǎng)及相關(guān)疾病的防治提供了重要信息。 實(shí)驗(yàn)中,使用Beacon Designer7.0軟件在H.suis gryB和ure B基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物及熒光探針,建立并優(yōu)化實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(real-time)檢測(cè)體系,并對(duì)體系的特異度和靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)。建立了一種快速、準(zhǔn)確的H.suis real-time PCR檢測(cè)方法,其檢測(cè)靈敏度比普通PCR高且耗時(shí)較短,為以后開(kāi)展相關(guān)檢測(cè)和分析奠定基礎(chǔ)。 第二部分：幽門螺桿菌重要蛋白的原核表達(dá)和純化 幽門螺桿菌Helicobacter pylori,簡(jiǎn)稱H.pylori)也是一種微需氧的革蘭氏陰性菌,為慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍的主要病原菌,并與胃癌和胃粘膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤(MALT)的發(fā)生密切相關(guān),被列為I類致癌因子。目前,H. pylori感染導(dǎo)致胃癌的致病機(jī)制仍不明確。 本研究選取與H. pylori感染導(dǎo)致胃癌發(fā)生密切相關(guān)的3種蛋白,通過(guò)蛋白生物信息學(xué)如信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)等系列分析、引物設(shè)計(jì)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增、連接構(gòu)建pET28a(+)表達(dá)載體后,通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后誘導(dǎo)表達(dá)并進(jìn)行純化,獲得大量預(yù)期大小的表達(dá)蛋白,該蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目標(biāo)蛋白氨基酸序列100%同源。本研究成功構(gòu)建了3種幽門螺桿菌的重組原核表達(dá)質(zhì)粒,且研究中獲得的純化蛋白可以為進(jìn)一步的蛋白功能研究及H.pylori致病機(jī)制研究提供一定的前期基礎(chǔ)。 第三部分：艾滋病相關(guān)支原體多重實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法的初步建立 穿透支原體(Mycoplasma penetrans, Mpe)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans, Mf)和梨支原體(Mycoplasma pirum, Mpi)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的艾滋病相關(guān)支原體,國(guó)外研究表明,這3種支原體是艾滋病感染的協(xié)同因子和發(fā)病的誘發(fā)因素。本研究的目的是建立一種快速、靈敏和特異的艾滋病相關(guān)支原體多重實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(Multiplex real-time PCR)檢測(cè)技術(shù)。使用Beacon Desigener7.0軟件在穿透支原體和發(fā)酵支原體的ftsZ基因以及梨支原體的rpoB基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)多重引物和熒光探針,建立并優(yōu)化艾滋病相關(guān)支原體Multiplex real-time PCR檢測(cè)體系。分別使用3種支原體陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品評(píng)價(jià)體系的靈敏度,使用8種其他支原體、14種常見(jiàn)致病菌和人類基因組核酸評(píng)價(jià)該體系的特異度,并與普通聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)方法進(jìn)行比較。該Multiplex real-time PCR方法對(duì)穿透支原體和發(fā)酵支原體檢測(cè)靈敏度為103拷貝,約為普通PCR的10倍,對(duì)梨支原體檢測(cè)靈敏度為102拷貝,約為普通PCR的100倍。該體系對(duì)8種其他支原體、14種常見(jiàn)致病菌和人類基因組均不能擴(kuò)增。本研究建立的Multiplex real-time PCR方法可同時(shí)快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)穿透支原體、發(fā)酵支原體和梨支原體。有望用于臨床標(biāo)本檢測(cè),完善對(duì)艾滋病相關(guān)支原體的檢測(cè)能力。
【關(guān)鍵詞】：豬螺桿菌 實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng) 幽門螺桿菌 蛋白表達(dá) 支原體
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 主要英文縮略語(yǔ)索引5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 第一部分 豬螺桿菌PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用11-32
• 前言11-14
• 材料與方法14-21
• 一、材料14-16
• 二、方法16-21
• 結(jié)果21-30
• 討論30-31
• 小結(jié)31-32
• 第二部分 幽門螺桿菌重要蛋白的原核表達(dá)和純化32-56
• 前言32-33
• 材料與方法33-47
• 一、材料33-40
• 二、方法40-47
• 結(jié)果47-54
• 討論54-55
• 小結(jié)55-56
• 第三部分 艾滋病相關(guān)支原體多重實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法的初步建立56-63
• 前言56-57
• 材料與方法57-59
• 結(jié)果59-62
• 討論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 綜述70-75
• 參考文獻(xiàn)72-75
• 發(fā)表論文75-76
• 致謝76

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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本文編號(hào)：723896