本文關(guān)鍵詞：人和羊IgG誘導(dǎo)細(xì)菌免疫球蛋白結(jié)合分子單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合噬菌體文庫不同的體外進(jìn)化結(jié)果

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【摘要】：金黃色葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A，，SpA)和鏈球菌蛋白G(streptococcal protein G，SpG)是細(xì)菌產(chǎn)生的特異結(jié)合宿主抗體的細(xì)菌免疫球蛋白結(jié)合蛋白(immunoglobulin (Ig)-binding proteins, IBPs)的代表分子。SpA和SpG均包含由多個(gè)的序列高度同源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域重復(fù)組成的抗體結(jié)合區(qū)，各單結(jié)構(gòu)域都具有完全的結(jié)合IgG的功能。 本研究構(gòu)建了兩個(gè)由SpA和SpG各單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組成的噬菌體展示文庫，通過人和羊IgG對這兩個(gè)文庫進(jìn)行親和篩選，以期能夠獲得對人和羊IgG具有特異優(yōu)勢結(jié)合能力的組合分子。使用PCR擴(kuò)增法制備SPA(A、B、C、E)、SPG(B2、B3)以及SPA(A、B、、D、E)、SPG(B2、B3)各結(jié)構(gòu)域核苷酸片段，在片段兩端通過引物引入XbaⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，同時(shí)在3’端引入3個(gè)氨基酸大小的隨機(jī)連接肽核苷酸序列，經(jīng)XbaⅠ酶消化各結(jié)構(gòu)域核苷酸片段，在LH連接酶作用下隨機(jī)相互連接并克隆于噬菌粒載體pCANTAB5S,并轉(zhuǎn)化TG1細(xì)胞，經(jīng)M13K07輔助噬菌體拯救，得到Ig結(jié)合分子單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合噬菌體展示文庫。用人和羊IgG同時(shí)對兩個(gè)文庫進(jìn)行親和篩選，每一輪篩選后均隨機(jī)挑選單克隆進(jìn)行PCR鑒定，檢測片段插入的大小分布情況，以評價(jià)篩選有效性;同時(shí)對篩選后文庫中的單克隆進(jìn)行序列測定，獲得展示序列終單結(jié)構(gòu)域的排列組合情況。篩選結(jié)果統(tǒng)一后，制備最終得到的各特異優(yōu)勢組合分子的單克隆噬菌體，通過噬菌體ELISA的方法來比較其與人和羊IgG的結(jié)合特性。 本研究成功構(gòu)建了噬菌體展示SpA （A、B、C、E）、 SpG B2、B3）（庫C）以及SpA（A、B、D、E）、SpG（B2、B3）（庫D）共六個(gè)單結(jié)合結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合文庫。其中單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合文庫庫C的庫容為8.5×10~6，噬菌體庫滴度為1.82×1012TU/Ml，PCR鑒定陽性片段插入率為78%（其中1個(gè)domain的組合占50%；2個(gè)domain的組合占16.7%；3個(gè)及3個(gè)以上domain的組合占8%）；庫D的庫容為8.1×10~6，噬菌體庫滴度為1.69×10~(12)TU/Ml，PCR鑒定陽性片段插入率為72%（1個(gè)domain的組合占40%；2個(gè)domain的組合占19.4%；3個(gè)及3個(gè)以上domain組合，占9.5%）。測序結(jié)果顯示，各單結(jié)構(gòu)域組合情況、正反向插入情況、連接肽均呈現(xiàn)隨機(jī)分布，所建文庫符合進(jìn)行體外進(jìn)化篩選要求。篩選最均獲得了SpA天然分子中不存在的單結(jié)構(gòu)域排列組合分子，庫C經(jīng)過人IgG誘導(dǎo)四輪篩選后，片段大小統(tǒng)一為2個(gè)domain，測序分析后組合為A-C，庫C經(jīng)過羊IgG誘導(dǎo)六輪篩選后，片段大小統(tǒng)一為2個(gè)domain，測序分析后組合為A-B3。庫D經(jīng)過人IgG誘導(dǎo)六輪篩選后，片段大小統(tǒng)一為3個(gè)domain，測序分析后組合為E-B-B3，庫D經(jīng)過羊IgG誘導(dǎo)六輪篩選后，片段大小統(tǒng)一為4個(gè)domain，測序分析后組合為D-A-B3-B3。噬菌體ELISA進(jìn)一步證實(shí)庫C得到的組合分子A-C對人IgG的結(jié)合能力高于組合分子A-B3，而組合分子A-C對羊IgG的結(jié)合能力低于于組合分子A-B3，與篩選結(jié)果完全吻合;然而，與庫C篩選結(jié)果不同的是，庫D得到的組合分子D-A-B3-B3對人和羊IgG的結(jié)合能力都高于組合分子E-B-B3，未顯示出抗體結(jié)合的特異性。 本研究成功使用人和羊IgG誘導(dǎo)細(xì)菌免疫球蛋白結(jié)合分子單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合噬菌體文庫完成體外進(jìn)化篩選，分別獲得到了與人和羊IgG具有不同結(jié)合優(yōu)勢的新型組合分子A-C、A-B3、E-B-B3、D-A-B3-B3，其中只有庫C得到的新型組合分子分別與人和羊IgG具有特異性結(jié)合能力。本研究還可為細(xì)菌IBP結(jié)構(gòu)功能以及IgG的Fc段結(jié)合分子的進(jìn)一步研究提供新的手段；并為IgG的純化、制備、檢測提供了新的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)菌噬菌體 免疫球蛋白G 定向分子進(jìn)化 基因文庫
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 縮略詞表10-11
• 前言11-14
• 第一部分 噬菌體展示 Ig 結(jié)合分子單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合文庫的構(gòu)建14-36
• 材料與方法16-27
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-35
• 討論35-36
• 第二部分 用人和羊 IgG 對噬菌體文庫的體外進(jìn)化篩選36-49
• 材料與方法36-39
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-46
• 討論46-49
• 總結(jié)49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 附錄53-54
• 致謝54-55
• 綜述55-60
• 參考文獻(xiàn)59-60

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳曉蘭,潘衛(wèi),戚中田;庚型肝炎病毒全基因組cDNA噬菌體隨機(jī)展示肽庫的構(gòu)建與鑒定[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年09期

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6 沈毅s

本文編號：714867