本文關(guān)鍵詞：半胱氨酸蛋白酶IdeS的原核表達、純化、活性鑒定及應(yīng)用

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【摘要】：抗體及相關(guān)的產(chǎn)品的出現(xiàn)標(biāo)志著在制藥領(lǐng)域中一種快速發(fā)展的新興藥物的到來。在癌癥和自身免疫病治療方面，抗體類藥物的重要性日益突出且日漸成為焦點。因此，為了保證藥品質(zhì)量及開發(fā)新藥，對于抗體類大分子的特性及表征分析也顯得格外重要。其中特異性水解大分子抗體對研究抗體的結(jié)構(gòu)及功能有著非常重要的意義。釀膿鏈球菌來源的免疫球蛋白G降解酶(Immunoglubulin G-degrading enzyme ofStreptococcus pyogenes, IdeS)是一種典型的半胱氨酸水解酶，可以在抗體的鉸鏈區(qū)的特定位點進行酶切，使IgG水解為完整的(Fab)2片段和Fc片段，因此可以更直觀、更快捷的提高抗體結(jié)構(gòu)的分辨能力并進行更精細的特征性分析。 IdeS獨特的底物選擇性，使它成為抗體類藥物表征分析的重要工具酶。相關(guān)研究報道表明，IdeS的酶切特異性要遠高于其他相關(guān)的蛋白酶，如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、Lys-C等，可以避免酶切后產(chǎn)生非特異性小碎片而導(dǎo)致分析困難。此外，IdeS還是一種高性能的蛋白酶，其穩(wěn)定的酶學(xué)活性也擴大了它的使用范圍。所以，IdeS是目前為止最適用的抗體類蛋白分析工具酶之一，但是該酶使用量大，目前關(guān)于該酶的提取或制備仍不夠高效，嚴(yán)重限制了該酶的應(yīng)用，新的重組表達策略成為目前研究的熱點。 然而目前為止，國內(nèi)尚無關(guān)于IdeS高效制備及特性研究的報道。因此，為了高效重組表達IdeS并驗證重組IdeS酶的特異性及活性，，本論文利用全基因合成方法獲得蛋白酶IdeS活性區(qū)部分的核苷酸序列并利用PCR技術(shù)在目的蛋白的羧基端加上His6標(biāo)簽，以利于酶與抗體反應(yīng)結(jié)束后通過純化除去該酶。本文通過融合GST的方式，使用原核表達載體pGEX-4T-2可溶性高效表達出一種全新的重組蛋白酶IdeS，經(jīng)過GST親和層析可以進一步高效純化，并在GST融合標(biāo)簽和蛋白酶之間加入腸激酶酶切位點，可以方便地進行標(biāo)簽的去除。純化出的高純度IdeS酶通過SDS-PAGE、HPLC-SEC和LC-MS進行了分析和鑒定，結(jié)果表明：重組蛋白酶IdeS的表達量高、特異性好、純度高，且在不同緩沖液中均具有較強的穩(wěn)定性，能夠滿足蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析對蛋白酶的高質(zhì)量要求，活性研究表明，IdeS發(fā)揮高活性的PH范圍是5.1~8.0，最適PH是6.6，反應(yīng)溫度在37℃左右。 最后，我們通過了一個特殊的抗體案例，其除了固定的Fc段N-糖基化修飾外，(Fab)2片段上也會有N-糖修飾或者O-糖修飾，這可能會在人體引起免疫原性反應(yīng)。而且，糖基化還會影響抗體與初生Fcγ受體(FcγR)的結(jié)合，進而影響抗體在血漿中的半衰期。我們通過該重組酶對該抗體進行了很好的質(zhì)譜鑒定，為以后抗體藥物的質(zhì)控及檢定提供了很好的范例，對抗體研發(fā)來說意義顯著，而且也可以應(yīng)用于生物仿制藥、生物改良藥和新一代抗體以及Fc-融合蛋白的研究。
【關(guān)鍵詞】：蛋白酶IdeS 蛋白純化 酶活分析 質(zhì)譜
【學(xué)位授予單位】：聊城大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 前言11-12
• 第一章 緒論12-26
• 1.1 IdeS 的簡介12
• 1.2 IdeS 結(jié)構(gòu)特征12-13
• 1.3 IdeS 的底物特異性13-14
• 1.4 IgG 及 IdeS 相互作用機理14-17
• 1.5 IdeS 酶學(xué)性質(zhì)的研究17-18
• 1.6 經(jīng)典的原核表達系統(tǒng)18-19
• 1.7 腸激酶的使用優(yōu)勢19
• 1.8 親和純化系統(tǒng)的建立及應(yīng)用19-21
• 1.9 HPLC-SEC 及 LC/MS 技術(shù)的分析檢測21-23
• 1.10 IdeS 研究現(xiàn)狀及思路23-26
• 第二章 材料和方法26-57
• 2.1 材料26-33
• 2.2 方法33-57
• 第三章 結(jié)果與分析57-76
• 3.1 pET32a(+)/IdeS 的構(gòu)建57-58
• 3.2 pGEX4T2/IdeS 的構(gòu)建58-61
• 3.3 pET32a(+)/IdeS/BL21 的誘導(dǎo)表達61-62
• 3.4 pGEX4T2/IdeS/BL21 的誘導(dǎo)表達62-64
• 3.5 pGEX4T2/IdeS/BL21 重組蛋白純化64-68
• 3.6 HPLC-SEC 檢測蛋白 IdeS 的酶活68-71
• 3.7 蛋白酶 IdeS 適用于不同緩沖液分析71-73
• 3.8 蛋白酶 IdeS 在抗體類藥物質(zhì)譜分析中的應(yīng)用73-76
• 第四章 結(jié)論與展望76-78
• 致謝78-79
• 參考文獻79-83
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文83

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 解庭波;;大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究進展[J];長江大學(xué)學(xué)報(自科版)醫(yī)學(xué)卷;2008年03期

2 任增亮;堵國成;陳堅;吳敬;;大腸桿菌高效表達重組蛋白策略[J];中國生物工程雜志;2007年09期

本文編號：713984