本文關(guān)鍵詞：南極磷蝦胰蛋白酶表達(dá)載體構(gòu)建與高效表達(dá)

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【摘要】：南極磷蝦屬節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱磷蝦目，這種無脊椎動(dòng)物是南極海域的關(guān)鍵物種，主要圍繞極地分布并集中于南冰洋，為多細(xì)胞生物中生物質(zhì)能最大、適應(yīng)環(huán)境最成功的動(dòng)物物種之一。 特殊寒冷的生活環(huán)境造就了南極磷蝦體內(nèi)很多活性物質(zhì)都具有較高的研究價(jià)值，其中以胰蛋白酶的低溫高效性較為突出。南極磷蝦胰蛋白酶已經(jīng)在清除機(jī)體壞死組織、治療角膜堿燒傷以及清除牙斑等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，并且成為輕工業(yè)、食品、醫(yī)藥等學(xué)科的研究熱點(diǎn)。 由于磷蝦樣品提取胰蛋白酶的現(xiàn)實(shí)困難和相對(duì)高昂的成本，本實(shí)驗(yàn)采用基因工程技術(shù)將南極磷蝦胰蛋白酶基因轉(zhuǎn)入工程菌中，利用基因工程技術(shù)表達(dá)目的蛋白并初步純化,為南極磷蝦胰蛋白酶的研究提供更加深入的資料和依據(jù)。 【研究內(nèi)容】（1）以南極磷蝦mRNA為模板，通過分析南極磷蝦胰蛋白酶基因，設(shè)計(jì)基因特異性引 物，逆轉(zhuǎn)錄得到南極磷蝦胰蛋白酶cDNA。（2）構(gòu)建pGEX-2T-TRY（TRY代表南極磷蝦胰蛋白酶）原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì) 胞，并經(jīng)PCR、雙酶切及測序進(jìn)行鑒定。（3）將pGEX-2T-TRY轉(zhuǎn)化入工程菌E.coli BL21，優(yōu)化表達(dá)條件，以實(shí)現(xiàn)目的蛋白的 表達(dá)。（4）工程菌經(jīng)超聲裂解，獲得目的蛋白。檢測目的蛋白的酶解活性并對(duì)目的蛋白初步 純化。 【研究結(jié)果】（1）利用TAIL-PCR技術(shù)獲得基因序列，經(jīng)分析比對(duì)確認(rèn)為南極磷蝦胰蛋白酶基因， 設(shè)計(jì)基因特異性引物，以南極磷蝦RNA為模板成功逆轉(zhuǎn)錄出cDNA。（2）構(gòu)建的pGEX-2T-TRY原核表達(dá)載體，經(jīng)PCR和雙酶切以及測序鑒定證明已構(gòu)建成 功。（3）工程菌E.coli BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，成功表達(dá)出融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié) 果分析，發(fā)現(xiàn)在55KDa處有明顯的目的蛋白條帶，與預(yù)期的結(jié)果一致。（4）選用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠來純化帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白，初步純化出目的蛋白， 但是尚未發(fā)現(xiàn)該蛋白具有酶活性。 【研究結(jié)論】 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了原核表達(dá)南極磷蝦胰蛋白酶的工程菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出帶有GST標(biāo)簽的目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析證明，在預(yù)期位置有明顯的蛋白條帶，，批量發(fā)酵菌體后，超聲破菌回收蛋白，對(duì)目的蛋白進(jìn)行了初步純化和酶活性檢測。
【關(guān)鍵詞】：南極磷蝦 胰蛋白酶 TAIL-PCR 克隆 載體構(gòu)建 表達(dá) 純化
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 導(dǎo)師簡介5
• 課題組成員5-9
• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 主要符號(hào)表13-14
• 第一部分 前言14-18
• 1.1 南極磷蝦研究開發(fā)現(xiàn)狀14-15
• 1.2 胰蛋白酶的研究現(xiàn)狀15-16
• 1.3 南極磷蝦酶的應(yīng)用價(jià)值16-18
• 第二部分 南極磷蝦胰蛋白酶 cDNA 的克隆與鑒定18-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料18-20
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)組織樣本18
• 2.1.2 試劑18-19
• 2.1.3 主要儀器19-20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法20-28
• 2.2.1 南極磷蝦基因組 DNA 的獲得20
• 2.2.2 南極磷蝦胰蛋白酶基因片段的獲得20-22
• 2.2.3 南極磷蝦胰蛋白酶全基因序列的獲得22-26
• 2.2.4 南極磷蝦胰蛋白酶 cDNA 的獲得26-28
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-35
• 2.3.1 提取南極磷蝦胰蛋白酶基因克隆結(jié)果28-30
• 2.3.2 重組質(zhì)粒 PCR 及酶切鑒定30
• 2.3.3 南極磷蝦胰蛋白酶的全基因序列圖及開放閱讀框（ORF）結(jié)構(gòu)圖30-32
• 2.3.4 南極磷蝦總 RNA 電泳結(jié)果32
• 2.3.5 南極磷蝦胰蛋白酶 cDNA 電泳結(jié)果32-33
• 2.3.6 多物種胰蛋白酶氨基酸多序列分析33-34
• 2.3.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析34-35
• 2.4 討論35-36
• 2.5 結(jié)論36-37
• 第三部分 南極磷蝦胰蛋白酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建37-45
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑37-38
• 3.1.1 菌株與載體37
• 3.1.2 LB 固體和液體培養(yǎng)基37
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑37
• 3.1.4 主要儀器37-38
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法38-40
• 3.2.1 質(zhì)粒 pGEX-2T 的驗(yàn)證38
• 3.2.2 雙酶切南極磷蝦胰蛋白酶 cDNA38-39
• 3.2.3 雙酶切質(zhì)粒 pGEX-2T39
• 3.2.4 連接并轉(zhuǎn)化 E.coli BL21 感受態(tài)細(xì)胞39-40
• 3.2.5 篩選并驗(yàn)證40
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-43
• 3.3.1 質(zhì)粒完整性驗(yàn)證結(jié)果40-41
• 3.3.2 雙酶切 pGEX-2T 及南極磷蝦胰蛋白酶 cDNA41-43
• 3.4 討論43-44
• 3.5 結(jié)論44-45
• 第四部分 融合蛋白的表達(dá)、鑒定與純化45-55
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料45-47
• 4.1.1 菌株45
• 4.1.2 試劑45-47
• 4.1.3 主要儀器47
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法47-51
• 4.2.1 表達(dá)47-49
• 4.2.2 優(yōu)化表達(dá)條件49
• 4.2.3 純化49-50
• 4.2.4 測定酶活性50-51
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-54
• 4.3.1 初步表達(dá)的 SDS-PAGE 分析51-52
• 4.3.2 優(yōu)化條件表達(dá)的 SDS-PAGE 分析52-53
• 4.3.3 Glutathione Sepharose 4B 純化后的 SDS-PAGE 分析53
• 4.3.4 蛋白純化前后的蛋白濃度測定53-54
• 4.3.5 酶活力測定結(jié)果54
• 4.4 討論54
• 4.5 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 綜述58-65
• 參考文獻(xiàn)63-65
• 攻讀學(xué)位期間已（待）發(fā)表的文章65-66
• 致謝66

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：712284