發(fā)布時間：2017-08-21 09:00

  本文關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌熱休克蛋白DnaJ相互作用蛋白的篩選及鑒定

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【摘要】：目的肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumonia，S. pn）熱休克蛋白DnaJ是一個毒力因子，但其對肺炎鏈球菌致病機制的作用尚不清楚，本文擬通過尋找DnaJ在S. pn中的相互作用蛋白來揭示其對細菌毒力的影響。 方法主要采用兩種蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)——免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP）和細菌雙雜交來進行相互作用蛋白的篩選與驗證。質(zhì)粒pAE03含有標簽蛋白——綠色熒光蛋白（GreenFluorescent Protein，GFP），將DnaJ整合到該質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒pAE03-dnaJ-gfp并轉(zhuǎn)化S. pn菌株D39。收集轉(zhuǎn)化細菌和野生型D39裂解液，用結(jié)合了GFP抗體的beads去捕獲帶GFP標簽的DnaJ和它結(jié)合的相互作用蛋白，捕獲蛋白質(zhì)混合物采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)化細菌與D39的差異蛋白質(zhì)通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/IonizationTime of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）鑒定；然后用細菌雙雜交技術(shù)驗證這種相互作用，并通過β-半乳糖苷酶實驗和westernblot檢測熱休克時這種相互作用對候選蛋白的影響。同時，本文構(gòu)建了誘餌質(zhì)粒pBT-dnaJ和肺炎鏈球菌基因組文庫，應(yīng)用細菌雙雜交技術(shù)篩選DnaJ相互作用的蛋白質(zhì)并用co-IP加以證實。根據(jù)候選蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果，用最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）實驗研究該相互作用對細菌耐藥性的影響。 結(jié)果應(yīng)用co-IP技術(shù)篩選并經(jīng)MALDI-TOF MS鑒定出9個可能與DnaJ有相互作用的蛋白，包括DnaK、Gap、Eno、SpxB等。細菌雙雜交技術(shù)進一步證實了DnaJ與其中3個蛋白——DnaK、Eno、SpxB間的相互作用。而β-半乳糖苷酶實驗和western blot證實，熱休克時DnaJ可以幫助Eno和SpxB正確折疊并保護它們不受降解，還可易化Eno的胞外分泌。同時，應(yīng)用細菌雙雜交技術(shù)篩選到了一個DnaJ相互作用的蛋白質(zhì)——SPD1264，，并通過co-IP證實兩者間確實存在相互作用。通過文獻查閱及初步的MIC實驗，表明該蛋白可能與細菌對青霉素、氨芐青霉素及卡那霉素的耐藥存在一定的聯(lián)系。 結(jié)論DnaJ蛋白可以通過影響Eno和SpxB的蛋白水平及胞外分泌，從而影響細菌的毒力；此外其還可能通過影響翻譯相關(guān)蛋白來影響細菌多種蛋白包括毒力因子的合成，這可能也是其影響細菌毒力的機制之一；同時DnaJ可與耐藥相關(guān)蛋白SPD1264相互作用，可能通過對該蛋白的調(diào)控影響細菌的耐藥。這些結(jié)果有助于我們更深入地理解DnaJ對S. pn毒力作用的機制及其與耐藥間的聯(lián)系。
【關(guān)鍵詞】：肺炎鏈球菌 DnaJ 蛋白相互作用 免疫共沉淀 細菌雙雜交
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.12;R3411
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 參考文獻13-14
• 第一部分 免疫共沉淀技術(shù)篩選肺炎鏈球菌熱休克蛋白 DnaJ 相互作用蛋白14-32
• 材料與方法14-21
• 結(jié)果21-27
• 討論27-29
• 參考文獻29-32
• 第二部分 細菌雙雜交技術(shù)篩選肺炎鏈球菌熱休克蛋白 DnaJ 相互作用蛋白及其與耐藥的聯(lián)系32-42
• 材料與方法32-35
• 結(jié)果35-39
• 討論39-41
• 參考文獻41-42
• 全文總結(jié)42-43
• 文獻綜述43-52
• 參考文獻48-52
• 致謝52-53
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄53-54

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 崔瑾;張群;董杰;姜慧;周愛娥;董姍姍;張雪梅;尹一兵;王虹;;肺炎鏈球菌dnaJ基因缺陷菌株的構(gòu)建及毒力變化的初步研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2011年19期

本文編號：711959