本文關鍵詞：肺炎鏈球菌熱休克蛋白DnaJ相互作用蛋白的篩選及鑒定

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【摘要】：目的肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumonia，S. pn）熱休克蛋白DnaJ是一個毒力因子，但其對肺炎鏈球菌致病機制的作用尚不清楚，本文擬通過尋找DnaJ在S. pn中的相互作用蛋白來揭示其對細菌毒力的影響。 方法主要采用兩種蛋白質(zhì)相互作用的技術——免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP）和細菌雙雜交來進行相互作用蛋白的篩選與驗證。質(zhì)粒pAE03含有標簽蛋白——綠色熒光蛋白（GreenFluorescent Protein，GFP），將DnaJ整合到該質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒pAE03-dnaJ-gfp并轉化S. pn菌株D39。收集轉化細菌和野生型D39裂解液，用結合了GFP抗體的beads去捕獲帶GFP標簽的DnaJ和它結合的相互作用蛋白，捕獲蛋白質(zhì)混合物采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，轉化細菌與D39的差異蛋白質(zhì)通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/IonizationTime of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）鑒定；然后用細菌雙雜交技術驗證這種相互作用，并通過β-半乳糖苷酶實驗和westernblot檢測熱休克時這種相互作用對候選蛋白的影響。同時，本文構建了誘餌質(zhì)粒pBT-dnaJ和肺炎鏈球菌基因組文庫，應用細菌雙雜交技術篩選DnaJ相互作用的蛋白質(zhì)并用co-IP加以證實。根據(jù)候選蛋白的生物信息學分析結果，用最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）實驗研究該相互作用對細菌耐藥性的影響。 結果應用co-IP技術篩選并經(jīng)MALDI-TOF MS鑒定出9個可能與DnaJ有相互作用的蛋白，包括DnaK、Gap、Eno、SpxB等。細菌雙雜交技術進一步證實了DnaJ與其中3個蛋白——DnaK、Eno、SpxB間的相互作用。而β-半乳糖苷酶實驗和western blot證實，熱休克時DnaJ可以幫助Eno和SpxB正確折疊并保護它們不受降解，還可易化Eno的胞外分泌。同時，應用細菌雙雜交技術篩選到了一個DnaJ相互作用的蛋白質(zhì)——SPD1264，，并通過co-IP證實兩者間確實存在相互作用。通過文獻查閱及初步的MIC實驗，表明該蛋白可能與細菌對青霉素、氨芐青霉素及卡那霉素的耐藥存在一定的聯(lián)系。 結論DnaJ蛋白可以通過影響Eno和SpxB的蛋白水平及胞外分泌，從而影響細菌的毒力；此外其還可能通過影響翻譯相關蛋白來影響細菌多種蛋白包括毒力因子的合成，這可能也是其影響細菌毒力的機制之一；同時DnaJ可與耐藥相關蛋白SPD1264相互作用，可能通過對該蛋白的調(diào)控影響細菌的耐藥。這些結果有助于我們更深入地理解DnaJ對S. pn毒力作用的機制及其與耐藥間的聯(lián)系。
【關鍵詞】：肺炎鏈球菌 DnaJ 蛋白相互作用 免疫共沉淀 細菌雙雜交
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.12;R3411
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 參考文獻13-14
• 第一部分 免疫共沉淀技術篩選肺炎鏈球菌熱休克蛋白 DnaJ 相互作用蛋白14-32
• 材料與方法14-21
• 結果21-27
• 討論27-29
• 參考文獻29-32
• 第二部分 細菌雙雜交技術篩選肺炎鏈球菌熱休克蛋白 DnaJ 相互作用蛋白及其與耐藥的聯(lián)系32-42
• 材料與方法32-35
• 結果35-39
• 討論39-41
• 參考文獻41-42
• 全文總結42-43
• 文獻綜述43-52
• 參考文獻48-52
• 致謝52-53
• 攻讀學位期間的研究成果及發(fā)表的學術論文目錄53-54

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 崔瑾;張群;董杰;姜慧;周愛娥;董姍姍;張雪梅;尹一兵;王虹;;肺炎鏈球菌dnaJ基因缺陷菌株的構建及毒力變化的初步研究[J];第三軍醫(yī)大學學報;2011年19期

本文編號：711959