本文關鍵詞：基于生物信息學分析的弓形蟲致密顆粒蛋白GRA3的疫苗設計與體內(nèi)驗證

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【摘要】：背景： 剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性有核細胞內(nèi)寄生原蟲,具有機會致病性,擁有十分廣泛的宿主,例如眾多哺乳動物,鳥類以及人類。弓形蟲病是嚴重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病,呈世界性分布。弓形蟲具有不同的基因型。分布在北美和歐洲的弓形蟲主要分為三種基因型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。不同基因型的弓形蟲致病機制和效應分子功能也有很大差異,亦即基因型／蟲株相關的致病機制(genotype/strain-associated pathogencsis)。近年,本實驗室分離獲得51株動物源和人源性弓形蟲株,經(jīng)國際通用的PCR-RFLP和MS分型,發(fā)現(xiàn)了Ⅰ型,ToxoD B%204,ToxoDB#205,Chinese1(ToxoDB#9)等。其中Chinese1型弓形蟲最為常見,占所有分離蟲株的近80%,為中國優(yōu)勢基因型。深入研究該基因型蟲株的相應分子和保護性抗原特征,對我國弓形蟲病的發(fā)病機制、免疫診斷、疫苗研發(fā)與防治都具有十分重要的意義。 目的： 探討我國流行的Chinese1基因型的弓形蟲株GRA3作為弓形蟲疫苗候選分子的潛在價值,為弓形蟲病的診斷和防治提供理論和實驗依據(jù)。運用生物信息學對蛋白分子進行分析,為高效候選疫苗分子的設計提供有價值的理論支持和導向依據(jù)。方法： 取小鼠傳代保種的Chinese1基因型強毒W(wǎng)h3株和成囊Wh6株,采用qRT-PCR檢測GRA3在蟲體內(nèi)表達。PCR擴增GRA3的目的片段,測序比較分析�？寺≈旅茴w粒蛋白(dense granules protein3,GRA3),構建了GRA3-GFP的真核表達質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒免疫小鼠后,攻擊感染弓形蟲,探究GRA3DNA疫苗的免疫保護作用。采用ELISA法檢測實驗小鼠體內(nèi)特異性抗體(IgG、IgGl和IgG2a)和細胞因子(IL-2.IL-4.IL-10和IFN-γ)表達水平；計算攻擊感染后小鼠生存死亡率和腦內(nèi)包囊數(shù)。通過生物信息學對Chinese1基因型蟲株致GRA3進行理化性質(zhì)分析、二級結構預測、抗原表位分析以及3D模型的構建等。分析動物實驗的免疫保護效果與生物信息學分析結果的吻合度。 結果： (1)毒力因子的qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),與其他Chinese1基因型蟲株相比,Wh6株GRA3的表達量最高(P0.01)。 (2)通過對GRA3的氨基酸序列比對,TgCtwh6和TgCtwh3的GRA3有22個氨基酸存在差異。 (3)成功構建并表達TgCtwh3、TgCtwh6兩個同一基因型不同毒力蟲株的GRA3-GFP真核質(zhì)粒。小鼠免疫保護實驗顯示,GRA3的核酸疫苗并無明顯的保護作用。免疫動物的特異性抗體(IgG、IgG1、IgG2a)和細胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、 IFN-γ),以及攻擊感染實驗小鼠死亡率和腦內(nèi)成囊數(shù),均無統(tǒng)計學的顯著差異(P0.05)。 (4)生物信息學分析預測見到,GRA3理化性質(zhì),抗原表位和初步建立GRA3的3D模型。通過結構分析可以得出GRA3有較多的Helix,Turns和Coil區(qū)域很少,預測抗原表位較少。分析結果在體內(nèi)的實驗得到了驗證。 結論： 本研究結果顯示,Chinese1基因型弓形蟲Wh3和Wh6蟲株致密顆粒蛋白GRA3不僅表達量存在差異,序列上也存在多態(tài)性。致密顆粒蛋白3(GRA3)預測抗原表位較少,結構較為簡單,免疫原性較差,不宜作為弓形蟲有效的疫苗候選分子。本研究表明,對疫苗候選分子預先進行生物信息學分析,有助于預測其是否具有研究價值,為體內(nèi)外的保護性免疫的研究提供了有力的預測手段。
【關鍵詞】：弓形蟲 GRA3 分子克隆表達 免疫保護 生物信息學
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 英文縮略詞對照表5-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 1.前言11-15
• 2.材料與方法15-37
• 3.結果37-58
• 4.討論58-61
• 5.結論61-62
• 6.參考文獻62-69
• 附錄一69-73
• 附錄二73-75
• 附錄三 綜述75-86
• 參考文獻82-86

【共引文獻】

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本文編號：711743