本文關(guān)鍵詞：基于生物信息學(xué)分析的弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白GRA3的疫苗設(shè)計(jì)與體內(nèi)驗(yàn)證

  更多相關(guān)文章： 弓形蟲(chóng) GRA3 分子克隆表達(dá) 免疫保護(hù) 生物信息學(xué)

【摘要】：背景： 剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)是一種專(zhuān)性有核細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng),具有機(jī)會(huì)致病性,擁有十分廣泛的宿主,例如眾多哺乳動(dòng)物,鳥(niǎo)類(lèi)以及人類(lèi)。弓形蟲(chóng)病是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的人獸共患寄生蟲(chóng)病,呈世界性分布。弓形蟲(chóng)具有不同的基因型。分布在北美和歐洲的弓形蟲(chóng)主要分為三種基因型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。不同基因型的弓形蟲(chóng)致病機(jī)制和效應(yīng)分子功能也有很大差異,亦即基因型／蟲(chóng)株相關(guān)的致病機(jī)制(genotype/strain-associated pathogencsis)。近年,本實(shí)驗(yàn)室分離獲得51株動(dòng)物源和人源性弓形蟲(chóng)株,經(jīng)國(guó)際通用的PCR-RFLP和MS分型,發(fā)現(xiàn)了Ⅰ型,ToxoD B%204,ToxoDB#205,Chinese1(ToxoDB#9)等。其中Chinese1型弓形蟲(chóng)最為常見(jiàn),占所有分離蟲(chóng)株的近80%,為中國(guó)優(yōu)勢(shì)基因型。深入研究該基因型蟲(chóng)株的相應(yīng)分子和保護(hù)性抗原特征,對(duì)我國(guó)弓形蟲(chóng)病的發(fā)病機(jī)制、免疫診斷、疫苗研發(fā)與防治都具有十分重要的意義。 目的： 探討我國(guó)流行的Chinese1基因型的弓形蟲(chóng)株GRA3作為弓形蟲(chóng)疫苗候選分子的潛在價(jià)值,為弓形蟲(chóng)病的診斷和防治提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。運(yùn)用生物信息學(xué)對(duì)蛋白分子進(jìn)行分析,為高效候選疫苗分子的設(shè)計(jì)提供有價(jià)值的理論支持和導(dǎo)向依據(jù)。方法： 取小鼠傳代保種的Chinese1基因型強(qiáng)毒W(wǎng)h3株和成囊Wh6株,采用qRT-PCR檢測(cè)GRA3在蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)。PCR擴(kuò)增GRA3的目的片段,測(cè)序比較分析�？寺≈旅茴w粒蛋白(dense granules protein3,GRA3),構(gòu)建了GRA3-GFP的真核表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒免疫小鼠后,攻擊感染弓形蟲(chóng),探究GRA3DNA疫苗的免疫保護(hù)作用。采用ELISA法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)特異性抗體(IgG、IgGl和IgG2a)和細(xì)胞因子(IL-2.IL-4.IL-10和IFN-γ)表達(dá)水平；計(jì)算攻擊感染后小鼠生存死亡率和腦內(nèi)包囊數(shù)。通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)Chinese1基因型蟲(chóng)株致GRA3進(jìn)行理化性質(zhì)分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、抗原表位分析以及3D模型的構(gòu)建等。分析動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的免疫保護(hù)效果與生物信息學(xué)分析結(jié)果的吻合度。 結(jié)果： (1)毒力因子的qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與其他Chinese1基因型蟲(chóng)株相比,Wh6株GRA3的表達(dá)量最高(P0.01)。 (2)通過(guò)對(duì)GRA3的氨基酸序列比對(duì),TgCtwh6和TgCtwh3的GRA3有22個(gè)氨基酸存在差異。 (3)成功構(gòu)建并表達(dá)TgCtwh3、TgCtwh6兩個(gè)同一基因型不同毒力蟲(chóng)株的GRA3-GFP真核質(zhì)粒。小鼠免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示,GRA3的核酸疫苗并無(wú)明顯的保護(hù)作用。免疫動(dòng)物的特異性抗體(IgG、IgG1、IgG2a)和細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、 IFN-γ),以及攻擊感染實(shí)驗(yàn)小鼠死亡率和腦內(nèi)成囊數(shù),均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異(P0.05)。 (4)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)見(jiàn)到,GRA3理化性質(zhì),抗原表位和初步建立GRA3的3D模型。通過(guò)結(jié)構(gòu)分析可以得出GRA3有較多的Helix,Turns和Coil區(qū)域很少,預(yù)測(cè)抗原表位較少。分析結(jié)果在體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證。 結(jié)論： 本研究結(jié)果顯示,Chinese1基因型弓形蟲(chóng)Wh3和Wh6蟲(chóng)株致密顆粒蛋白GRA3不僅表達(dá)量存在差異,序列上也存在多態(tài)性。致密顆粒蛋白3(GRA3)預(yù)測(cè)抗原表位較少,結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單,免疫原性較差,不宜作為弓形蟲(chóng)有效的疫苗候選分子。本研究表明,對(duì)疫苗候選分子預(yù)先進(jìn)行生物信息學(xué)分析,有助于預(yù)測(cè)其是否具有研究?jī)r(jià)值,為體內(nèi)外的保護(hù)性免疫的研究提供了有力的預(yù)測(cè)手段。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲(chóng) GRA3 分子克隆表達(dá) 免疫保護(hù) 生物信息學(xué)
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 英文縮略詞對(duì)照表5-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 1.前言11-15
• 2.材料與方法15-37
• 3.結(jié)果37-58
• 4.討論58-61
• 5.結(jié)論61-62
• 6.參考文獻(xiàn)62-69
• 附錄一69-73
• 附錄二73-75
• 附錄三 綜述75-86
• 參考文獻(xiàn)82-86

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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7 周英武;人參皂苷Rg1對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞效應(yīng)與分子機(jī)制的研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2011年

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10 張乃元;針刺對(duì)過(guò)敏性鼻炎大鼠免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制的研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2011年

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本文編號(hào)：711743