本文關鍵詞：卡介苗胞壁糖脂組分的分離純化及免疫活性研究

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【摘要】：目的：為了研究結核分枝桿菌糖脂組分的免疫活性,本實驗以卡介苗(Bacille Calmette Guerin, BCG)為原料,分離其糖脂組分,從糖脂的免疫原性和佐劑效應方面研究BCG胞壁糖脂類組分的免疫活性。抗原活性包括細胞免疫和體液免疫；佐劑效應,則是與現(xiàn)有的佐劑陽離子脂質體DDA混合,分析BCG胞壁糖脂是否能夠作為佐劑輔助提高蛋白疫苗的免疫效應。 方法：首先以批量擴增的BCG為原料,用氯仿：甲醇(2：1)反復萃取獲得總糖脂,再采用TLC,硅膠柱層析方法得到糖脂組分Ga, Gb,將Ga和Gb分別與陽離子脂質體DDA混合作為結核分枝桿菌抗原Ag85B的佐劑疫苗免疫C57BL／6小鼠,免疫五周后檢測脾臟淋巴細胞抗原特異性IFN-γ的分泌水平及抗體水平來分析兩種糖脂組分的的佐劑效應。 以上述方法獲得的總脂為基礎,采用硅膠柱層析,凝膠柱層析以及薄層層析相結合的分離純化條件得到八種糖脂組分,通過刺激BCG免疫C57BL／6小鼠脾臟淋巴細胞,ELISPOT檢測IFN-γ分泌水平的方法來分析八種糖脂組分的細胞免疫原性,并用改良的ELISA方法檢測這些小鼠中分別抗八種糖脂抗原的IgG抗體水平。除此之外,我們還檢測了這八種糖脂組分在結核感染病人及健康對照中的特異性IgG抗體水平,分析其在結核病人中的體液免疫反應。 我們進一步研究BCG胞壁糖脂組分的化學結構特性。挑選糖脂Ga重點解析其結構特點,采用高分辨質譜,紅外質譜,核磁共振光譜方法簡單分析兩種糖脂的結構,并根據(jù)已報道文獻來判斷其所述類別。 結果：我們發(fā)現(xiàn)在DDA的基礎上加入糖脂Ga后,脾臟分泌IFN-γ的水平降低(P=0.071),血清中IgG1的水平降低而抗體IgG2b的水平則相反；DDA+Gb佐劑組的IFN-γ的分泌水平高于BCG組(P=0.054)。其次從BCG表面分離得到的糖脂組分G1, G2, G4, G7, G8刺激BCG免疫小鼠脾臟淋巴細胞產(chǎn)生IFN-γ,且刺激產(chǎn)生IFN-γ分泌的能力與結核分枝桿菌抗原Ag85B相近。最后我們發(fā)現(xiàn)結核感染人群針對糖脂G2,G3的IgG水平最高(P0.05),且明顯高于健康人群(P0.001)。我們根據(jù)文獻報道以及各譜圖綜合解析推斷Ga是一種鏈狀脂肪族酯類化合物。 結論：本實驗所分離得到的BCG胞壁糖脂組分均具有免疫活性,Ga, Gb具有免疫調(diào)節(jié)功能。G2,G3在結核病人和健康對照人群中的IgG抗體水平差異顯著,有望成為活動性結核診斷的生物標記。
【關鍵詞】：結核病 卡介苗 糖脂 細胞壁 佐劑
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文縮略詞表7-10
• 前言10-13
• 1 實驗材料13-15
• 1.1 實驗動物13
• 1.2 主要材料13
• 1.3 主要儀器13-15
• 2 實驗方法15-30
• 2.1 結核分枝桿菌抗原Ag85B的制備15-18
• 2.1.1 抗原Ag85B蛋白的表達15
• 2.1.2 純化步驟15-16
• 2.1.3 SDS-PAGE蛋白電泳的配置及條件16-17
• 2.1.4 蛋白濃度測定17-18
• 2.2 BCG胞壁糖脂組分分離18-21
• 2.2.1 相關培養(yǎng)基及試劑的配置18-19
• 2.2.2 BCG增菌及總脂萃取19-20
• 2.2.3 糖脂組分分離純化方法一20
• 2.2.4 糖脂組分分離純化方法二20-21
• 2.3 糖脂組分活性檢測21-29
• 2.3.1 ELISPOT方法檢測八種糖脂的細胞免疫活性21-23
• 2.3.2 體液免疫活性檢測23-25
• 2.3.3 疫苗佐劑活性檢測25-29
• 2.4 糖脂Ga的結構分析29-30
• 3 實驗結果30-42
• 3.1 Ag85B表達純化結果30
• 3.2 糖脂分離方法一所獲組分活性及結構分析30-36
• 3.2.1 總脂萃取結果30-31
• 3.2.2 糖脂Ga,Gb的分離純化結果31-32
• 3.2.3 糖脂Ga,Gb的佐劑效應32-34
• 3.2.4 糖脂Ga的結構分析34-36
• 3.3 糖脂分離方法二所獲組分活性分析36-42
• 3.3.1 八種糖脂組分的分離純化結果36-37
• 3.3.2 八種糖脂抗原刺激BCG初免小鼠脾臟淋巴細胞IFN-γ的分泌水平37-39
• 3.3.3 不同人群針對八種糖脂抗原的特異性IgG抗體水平39-42
• 4 討論42-45
• 5 結論45-46
• 6 綜述46-50
• 7 參考文獻50-57
• 8 研究成果57-58
• 9 致謝58

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1 高聆，張黎華，周序斌，王景梓，，吳葆杰;甘糖酯抗實驗性內(nèi)皮細胞損傷作用的研究[J];山東醫(yī)科大學學報;1994年03期

2 梁伯平,梁春卉;58例高血壓病人血漿內(nèi)皮素水平分析[J];天津醫(yī)藥;1999年08期

3 張積仁,張德勝,張學庸,陳希陶,顧天爵;胃癌中性糖脂的分離及純化[J];第四軍醫(yī)大學學報;1989年06期

4 曹東旭;楊書文;劉娟娟;王sョ

本文編號：711510