本文關(guān)鍵詞：谷胱甘肽過氧化物酶GPX2對(duì)p53的調(diào)控及作用機(jī)制研究

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【摘要】：GPX2(谷胱甘肽過氧化物酶2)是GPX家族成員，是人體中主要的酶類抗氧化分子，研究發(fā)現(xiàn)GPX2與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，GPX2還具有抗凋亡、抗炎癥的功能。p53是重要的腫瘤抑制基因，其編碼的蛋白質(zhì)作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、凋亡及維持基因組穩(wěn)定性等方面起重要調(diào)控作用。研究還發(fā)現(xiàn)p53也具有促氧化和抗氧化雙重活性，調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)室利用高通量酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)，GPX2可能與p53存在蛋白質(zhì)相互作用，但對(duì)于兩者之間相互作用的分子機(jī)制及生物學(xué)意義并無(wú)任何報(bào)道。鑒于GPX2和p53兩者均與腫瘤發(fā)生發(fā)展及氧化應(yīng)激存在密切聯(lián)系，我們推測(cè)兩者相互作用很可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展及氧化應(yīng)激過程中具有重要生物學(xué)意義。 本文首先利用免疫共沉淀和GST-pull down技術(shù)，證實(shí)GPX2與p53存在相互作用，并確定了兩者相互作用結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)GPX2可以劑量依賴方式抑制p53轉(zhuǎn)錄活性；Realtime PCR及Western Blot方法檢測(cè)GPX2對(duì)p53及其下游靶基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GPX2可下調(diào)p53及其下游靶基因MDM2、Bax、p21等的表達(dá)。對(duì)GPX2抑制p53活性的分子機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，GPX2可明顯促進(jìn)p53的降解，降低p53蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，但泛素化實(shí)驗(yàn)表明GPX2對(duì)p53泛素化水平無(wú)明顯影響。對(duì)GPX2調(diào)控p53的生物學(xué)意義進(jìn)行初步研究發(fā)現(xiàn)，HCT116p53+/+細(xì)胞中敲低GPX2影響細(xì)胞G0/G1期阻滯，而在HCT116p53-/-細(xì)胞中敲低GPX2則對(duì)細(xì)胞周期沒有明顯影響，表明GPX2以p53依賴的方式影響細(xì)胞周期。為進(jìn)一步研究GPX2生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了pCDH-GPX2過表達(dá)慢病毒和pSicoR-GPX2干涉慢病毒載體，獲得穩(wěn)定過表達(dá)/干涉GPX2的慢病毒。感染GPX2干涉慢病毒的HepG2細(xì)胞表現(xiàn)對(duì)凋亡的易感性，促凋亡蛋白Bax發(fā)生活化，而抗凋亡蛋白Bcl-2則表達(dá)下調(diào)。 綜上，本研究首次發(fā)現(xiàn)GPX2是一種新的p53負(fù)調(diào)控因子，可通過與p53相互作用，，促進(jìn)p53蛋白質(zhì)降解，抑制p53轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)p53下游靶基因，進(jìn)而參與對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控。此外，成功構(gòu)建了GPX2過表達(dá)和干涉慢病毒，為進(jìn)一步研究GPX2功能奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：谷胱甘肽過氧化物酶2 抑癌基因p53 蛋白質(zhì)相互作用 腫瘤細(xì)胞 細(xì)胞周期
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-9
• 前言9-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-20
• 1.1 谷胱甘肽過氧化物酶家族10-15
• 1.2 p53 及其功能介紹15-19
• 1.3 本課題研究意義19-20
• 第二章 GPX2 通過與 p53 相互作用調(diào)控其穩(wěn)定性20-44
• 2.1 材料與方法20-28
• 2.1.1 質(zhì)粒20
• 2.1.2 細(xì)胞20
• 2.1.3 常用試劑及試劑盒20-21
• 2.1.4 主要溶液配制21-22
• 2.1.5 一般細(xì)胞培養(yǎng)條件22
• 2.1.6 細(xì)胞總蛋白提取22
• 2.1.7 Western Blot22-23
• 2.1.8 Co-IP23-24
• 2.1.9 GST-pull down24-25
• 2.1.10 細(xì)胞共定位25
• 2.1.11 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)25-26
• 2.1.12 細(xì)胞總 RNA 提取26
• 2.1.13 RT-PCR26-27
• 2.1.14 Real-time RCR27
• 2.1.15 蛋白穩(wěn)定性27
• 2.1.16 泛素化實(shí)驗(yàn)27
• 2.1.17 細(xì)胞周期檢測(cè)27-28
• 2.1.18 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析28
• 2.2 結(jié)果與討論28-43
• 2.2.1 GPX2 在腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)28
• 2.2.2 GPX2 與 p53 的相互作用28-30
• 2.2.3 GPX2 與 p53 在細(xì)胞核存在共定位30-31
• 2.2.4 GPX2 與 p53 相互作用結(jié)構(gòu)域的確定31-32
• 2.2.5 GPX2 對(duì) p53 及其下游靶基因轉(zhuǎn)錄活性的影響32-34
• 2.2.6 過表達(dá) GPX2 下調(diào) p53 下游靶基因的表達(dá)水平34-36
• 2.2.7 敲低 GPX2 上調(diào) p53 下游靶基因表達(dá)水平36-38
• 2.2.8 過表達(dá) GPX2 對(duì) p53 半衰期的影響38-39
• 2.2.9 干涉 GPX2 對(duì) p53 蛋白半衰期的影響39-40
• 2.2.10 GPX2 對(duì) p53 泛素化水平影響40-41
• 2.2.11 GPX2 以 p53 依賴的方式調(diào)控細(xì)胞周期41-43
• 2.3 小結(jié)43-44
• 第三章 GPX2 慢病毒系統(tǒng)的構(gòu)建及其細(xì)胞效應(yīng)44-59
• 3.1 材料與方法44-49
• 3.1.1 細(xì)胞與菌株44
• 3.1.2 常用試劑及試劑盒44-45
• 3.1.3 主要溶液配制45
• 3.1.4 GPX2 慢病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建45-47
• 3.1.4.1 擴(kuò)增目的片段45
• 3.1.4.2 目的片段回收45-46
• 3.1.4.3 雙酶切46
• 3.1.4.4 雙酶切產(chǎn)物回收46
• 3.1.4.5 連接46
• 3.1.4.6 轉(zhuǎn)化46
• 3.1.4.7 菌落 PCR46-47
• 3.1.4.8 雙酶切鑒定47
• 3.1.4.9 質(zhì)粒提取47
• 3.1.5 GPX2 慢病毒干涉載體的構(gòu)建47
• 3.1.6 慢病毒包裝47-48
• 3.1.7 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)病毒滴度48
• 3.1.8 慢病毒感染效果檢測(cè)48
• 3.1.9 流式細(xì)胞術(shù)和 Western blot 檢測(cè)48-49
• 3.1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析49
• 3.2 結(jié)果與討論49-58
• 3.2.1 GPX2 慢病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建和包裝49-52
• 3.2.2 GPX2 慢病毒干涉載體的構(gòu)建和包裝52-58
• 3.2.2.1 GPX2 干涉載體的構(gòu)建和鑒定52-53
• 3.2.2.2 慢病毒包裝、純化、濃縮及滴度測(cè)定53-54
• 3.2.2.3 干涉慢病毒 pSicoR-GPX2 的表達(dá)鑒定54-56
• 3.2.2.4 敲低 GPX2 的表達(dá)對(duì) HepG2 細(xì)胞凋亡的影響56-58
• 3.3 小結(jié)58-59
• 第四章 結(jié)論和展望59-60
• 4.1 結(jié)論59
• 4.2 展望59-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 附錄66-68
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明68-69
• 致謝69

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