本文關鍵詞：谷胱甘肽過氧化物酶GPX2對p53的調(diào)控及作用機制研究

  更多相關文章： 谷胱甘肽過氧化物酶2 抑癌基因p53 蛋白質(zhì)相互作用 腫瘤細胞 細胞周期

【摘要】：GPX2(谷胱甘肽過氧化物酶2)是GPX家族成員，是人體中主要的酶類抗氧化分子，研究發(fā)現(xiàn)GPX2與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關。此外，GPX2還具有抗凋亡、抗炎癥的功能。p53是重要的腫瘤抑制基因，其編碼的蛋白質(zhì)作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，在細胞生長、分化、增殖、凋亡及維持基因組穩(wěn)定性等方面起重要調(diào)控作用。研究還發(fā)現(xiàn)p53也具有促氧化和抗氧化雙重活性，調(diào)控機體氧化應激反應。實驗室利用高通量酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)，GPX2可能與p53存在蛋白質(zhì)相互作用，但對于兩者之間相互作用的分子機制及生物學意義并無任何報道。鑒于GPX2和p53兩者均與腫瘤發(fā)生發(fā)展及氧化應激存在密切聯(lián)系，我們推測兩者相互作用很可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展及氧化應激過程中具有重要生物學意義。 本文首先利用免疫共沉淀和GST-pull down技術(shù)，證實GPX2與p53存在相互作用，并確定了兩者相互作用結(jié)構(gòu)域。進一步利用熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)GPX2可以劑量依賴方式抑制p53轉(zhuǎn)錄活性；Realtime PCR及Western Blot方法檢測GPX2對p53及其下游靶基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)過表達GPX2可下調(diào)p53及其下游靶基因MDM2、Bax、p21等的表達。對GPX2抑制p53活性的分子機制進行研究發(fā)現(xiàn)，GPX2可明顯促進p53的降解，降低p53蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，但泛素化實驗表明GPX2對p53泛素化水平無明顯影響。對GPX2調(diào)控p53的生物學意義進行初步研究發(fā)現(xiàn)，HCT116p53+/+細胞中敲低GPX2影響細胞G0/G1期阻滯，而在HCT116p53-/-細胞中敲低GPX2則對細胞周期沒有明顯影響，表明GPX2以p53依賴的方式影響細胞周期。為進一步研究GPX2生物學功能，我們構(gòu)建了pCDH-GPX2過表達慢病毒和pSicoR-GPX2干涉慢病毒載體，獲得穩(wěn)定過表達/干涉GPX2的慢病毒。感染GPX2干涉慢病毒的HepG2細胞表現(xiàn)對凋亡的易感性，促凋亡蛋白Bax發(fā)生活化，而抗凋亡蛋白Bcl-2則表達下調(diào)。 綜上，本研究首次發(fā)現(xiàn)GPX2是一種新的p53負調(diào)控因子，可通過與p53相互作用，，促進p53蛋白質(zhì)降解，抑制p53轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)p53下游靶基因，進而參與對細胞周期的調(diào)控。此外，成功構(gòu)建了GPX2過表達和干涉慢病毒，為進一步研究GPX2功能奠定了基礎。
【關鍵詞】：谷胱甘肽過氧化物酶2 抑癌基因p53 蛋白質(zhì)相互作用 腫瘤細胞 細胞周期
【學位授予單位】：天津大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-9
• 前言9-10
• 第一章 文獻綜述10-20
• 1.1 谷胱甘肽過氧化物酶家族10-15
• 1.2 p53 及其功能介紹15-19
• 1.3 本課題研究意義19-20
• 第二章 GPX2 通過與 p53 相互作用調(diào)控其穩(wěn)定性20-44
• 2.1 材料與方法20-28
• 2.1.1 質(zhì)粒20
• 2.1.2 細胞20
• 2.1.3 常用試劑及試劑盒20-21
• 2.1.4 主要溶液配制21-22
• 2.1.5 一般細胞培養(yǎng)條件22
• 2.1.6 細胞總蛋白提取22
• 2.1.7 Western Blot22-23
• 2.1.8 Co-IP23-24
• 2.1.9 GST-pull down24-25
• 2.1.10 細胞共定位25
• 2.1.11 熒光素酶報告基因檢測25-26
• 2.1.12 細胞總 RNA 提取26
• 2.1.13 RT-PCR26-27
• 2.1.14 Real-time RCR27
• 2.1.15 蛋白穩(wěn)定性27
• 2.1.16 泛素化實驗27
• 2.1.17 細胞周期檢測27-28
• 2.1.18 統(tǒng)計學分析28
• 2.2 結(jié)果與討論28-43
• 2.2.1 GPX2 在腫瘤細胞系中的表達28
• 2.2.2 GPX2 與 p53 的相互作用28-30
• 2.2.3 GPX2 與 p53 在細胞核存在共定位30-31
• 2.2.4 GPX2 與 p53 相互作用結(jié)構(gòu)域的確定31-32
• 2.2.5 GPX2 對 p53 及其下游靶基因轉(zhuǎn)錄活性的影響32-34
• 2.2.6 過表達 GPX2 下調(diào) p53 下游靶基因的表達水平34-36
• 2.2.7 敲低 GPX2 上調(diào) p53 下游靶基因表達水平36-38
• 2.2.8 過表達 GPX2 對 p53 半衰期的影響38-39
• 2.2.9 干涉 GPX2 對 p53 蛋白半衰期的影響39-40
• 2.2.10 GPX2 對 p53 泛素化水平影響40-41
• 2.2.11 GPX2 以 p53 依賴的方式調(diào)控細胞周期41-43
• 2.3 小結(jié)43-44
• 第三章 GPX2 慢病毒系統(tǒng)的構(gòu)建及其細胞效應44-59
• 3.1 材料與方法44-49
• 3.1.1 細胞與菌株44
• 3.1.2 常用試劑及試劑盒44-45
• 3.1.3 主要溶液配制45
• 3.1.4 GPX2 慢病毒過表達載體的構(gòu)建45-47
• 3.1.4.1 擴增目的片段45
• 3.1.4.2 目的片段回收45-46
• 3.1.4.3 雙酶切46
• 3.1.4.4 雙酶切產(chǎn)物回收46
• 3.1.4.5 連接46
• 3.1.4.6 轉(zhuǎn)化46
• 3.1.4.7 菌落 PCR46-47
• 3.1.4.8 雙酶切鑒定47
• 3.1.4.9 質(zhì)粒提取47
• 3.1.5 GPX2 慢病毒干涉載體的構(gòu)建47
• 3.1.6 慢病毒包裝47-48
• 3.1.7 流式細胞術(shù)測病毒滴度48
• 3.1.8 慢病毒感染效果檢測48
• 3.1.9 流式細胞術(shù)和 Western blot 檢測48-49
• 3.1.10 統(tǒng)計學分析49
• 3.2 結(jié)果與討論49-58
• 3.2.1 GPX2 慢病毒過表達載體的構(gòu)建和包裝49-52
• 3.2.2 GPX2 慢病毒干涉載體的構(gòu)建和包裝52-58
• 3.2.2.1 GPX2 干涉載體的構(gòu)建和鑒定52-53
• 3.2.2.2 慢病毒包裝、純化、濃縮及滴度測定53-54
• 3.2.2.3 干涉慢病毒 pSicoR-GPX2 的表達鑒定54-56
• 3.2.2.4 敲低 GPX2 的表達對 HepG2 細胞凋亡的影響56-58
• 3.3 小結(jié)58-59
• 第四章 結(jié)論和展望59-60
• 4.1 結(jié)論59
• 4.2 展望59-60
• 參考文獻60-66
• 附錄66-68
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明68-69
• 致謝69

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