發(fā)布時間：2017-08-20 17:16

  本文關(guān)鍵詞：嗎啡誘導(dǎo)的斑馬魚條件性位置偏愛模型的建立及中藥的干預(yù)機制

  更多相關(guān)文章： 斑馬魚 嗎啡 條件性位置偏愛 阿片受體 谷氨酸受體 青藤堿

【摘要】：研究背景 藥物依賴一直以來都是全球廣泛關(guān)注的一個話題,藥物的濫用和毒品的廣泛傳播是導(dǎo)致藥物依賴的主要原因。目前,阿片類藥物是全球濫用情況最嚴(yán)重的藥物之一,該藥物濫用問題已成為一個世界公共衛(wèi)生和社會問題。阿片類藥物不僅能使人產(chǎn)生強烈的欣快感,同時還能有效的抑制呼吸、咳嗽中樞并具有興奮神經(jīng)中樞作用,而最令人頭疼不已的是,阿片類成癮后即使戒斷,仍存在難以控制的戒斷反應(yīng),造成吸食者出現(xiàn)不斷的復(fù)吸,因此全球每年都有幾十萬人至幾百萬人因為吸食阿片類毒品而死亡。 現(xiàn)階段針對阿片類藥物成癮的治療方式主要有美沙酮、丁丙諾啡等的替代治療及α2受體激動劑及鎮(zhèn)靜催眠類藥物的非替代治療,而中草藥治療作為一種非替代治療方式,因其具有撤出容易,本身無成癮性的優(yōu)勢,逐漸在成癮治療方面發(fā)揮重要作用。 大量研究表明,阿片類藥物成癮及戒斷與阿片受體、谷氨酸受體及多巴胺受體的調(diào)控密切相關(guān)。μ阿片受體和δ阿片受體能共同介導(dǎo)阿片系統(tǒng)的獎賞效應(yīng),誘導(dǎo)動物產(chǎn)生條件性位置偏愛(CPP)行為。通過阻斷多巴胺受體限速酶TH和NMDA受體在動物腦內(nèi)的傳遞能改變阿片類藥物引起的動物行為學(xué)的變化。因此,研究阿片類成癮動物腦內(nèi)阿片受體、谷氨酸受體及多巴胺受體的變化及變化趨勢能夠更深入的了解阿片類藥物成癮機制,為尋找阿片類戒斷藥物提供方向和依據(jù)。 目前判斷動物成癮的主要指標(biāo)是觀察其行為學(xué)上表現(xiàn)是否發(fā)生變化,條件性位置偏愛模型(CPP)是目前測定動物獎賞效應(yīng)的最有效手段之一,也是評價藥物精神依賴的有效方法。然而,目前國內(nèi)利用CPP進(jìn)行藥物依賴的研究主要集中在大小鼠等嚙齒動物模型,而少有利用其它模型來進(jìn)行藥物依賴研究的報道。而單一的動物模型往往不足以證明藥物的確切效果,在研究過程中存在很大的局限性。因此,我們亟待尋找一種新的模型生物,并將其引入藥物依賴研究領(lǐng)域,為將來成癮治療藥物篩選提供多模型的支持。 斑馬魚(Danio rerio, zebrafish)是一種常見的熱帶觀賞魚,因其生長周期短,胚胎發(fā)育透明,產(chǎn)卵量多,易于飼養(yǎng)等眾多優(yōu)勢被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究。近年來,斑馬魚也越來越多的被應(yīng)用于行為學(xué)研究領(lǐng)域,有研究表明,斑馬魚腦內(nèi)也存在與嚙齒動物相似的阿片受體及谷氨酸受體、多巴胺受體等,因此,利用斑馬魚動物模型進(jìn)行阿片類藥物依賴的研究具有極大的可行性。 實驗?zāi)康?1.建立嗎啡誘導(dǎo)的斑馬魚條件性位置偏愛模型,并對模型進(jìn)行驗證。在模型建立成功后,利用中藥有效成分對嗎啡依賴的斑馬魚進(jìn)行干預(yù),觀察藥物干預(yù)后斑馬魚行為學(xué)的變化。 2.采用q-PCR的方法,檢測嗎啡誘導(dǎo)的斑馬魚腦內(nèi)阿片受體水平的變化,并觀察中藥干預(yù)后,斑馬魚腦內(nèi)相關(guān)受體水平的變化。 3.采用免疫組化的方法,檢測嗎啡誘導(dǎo)的斑馬魚腦內(nèi)TH和NR2B受體表達(dá)的變化,并觀察中藥干預(yù)后,相關(guān)受體表達(dá)水平是否發(fā)生改變。 4.利用斑馬魚胚胎驗證中藥有效成分青藤堿及陽性藥美沙酮是否具有胚胎毒性,為青藤堿應(yīng)用于臨床戒毒提供毒理學(xué)的依據(jù)。 實驗方法 1.嗎啡誘導(dǎo)的斑馬魚條件性位置偏愛模型的建立 自制CPP魚缸(一缸為透明,一缸為褐色),褐色箱體部分為斑馬魚的偏愛箱,透明箱體部分為非偏愛箱(伴藥箱)。取基線測定合格(斑馬魚在非偏愛箱中的活動時間≥8min)的斑馬魚60條,稱重,隨機分為生理鹽水組,30、40、50、60、90μg·g-1嗎啡模型組,每組10條,雌雄各半。于正式實驗d1測定斑馬魚15min內(nèi)在CPP箱透明側(cè)(非偏愛箱)的活動時間,并用Noldus EthoVisionXT8.5軟件追蹤斑馬魚在CPP箱中的運動軌跡(5min)。于實驗d2、d4、d6斑馬魚腹腔注射各濃度嗎啡(空白組注射生理鹽水),將其放入伴藥箱內(nèi)40min。d3、d5同一時間斑馬魚腹腔注射與嗎啡同體積生理鹽水,將其放入偏愛箱內(nèi)40min。在末次給藥24h后即d7再次測定斑馬魚在非偏愛箱中的活動時間并比較訓(xùn)練前后各條斑馬魚在伴藥箱活動時間的差值,并分析斑馬魚在非偏愛箱中的運動軌跡及運動總路程。 2.中藥有效成分青藤堿對嗎啡誘導(dǎo)的斑馬魚藥物依賴的干預(yù) 取基線測定合格的斑馬魚50條,稱重,隨機分為生理鹽水組,嗎啡模型組,嗎啡+美沙酮組(40μg-g-1),嗎啡+青藤堿低劑量組(40μg·g-1),嗎啡+青藤堿高劑量組(80μg-g-1),每組10條,雌雄各半。給藥方法同造模給藥。于每日造模給藥12h后,青藤堿高低劑量組和美沙酮給藥組斑馬魚分別注射各濃度藥物,生理鹽水組和模型組注射同體積生理鹽水。末次給藥12h后即d7再次測定斑馬魚在非偏愛箱中的活動時間并比較訓(xùn)練前后各條斑馬魚在伴藥箱活動時間的差值,同時分析斑馬魚在非偏愛箱中的運動軌跡及運動總路程。 3.青藤堿對嗎啡依賴斑馬魚腦內(nèi)阿片受體和TH、NR2B表達(dá)的影響 各組斑馬魚行為學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)束后,斑馬魚迅速冷凍處死,顯微鏡下取腦組織。采用q-PCR技術(shù)檢測各組斑馬魚腦組織中zfinor、zfdor1、zfdor2mRNA的表達(dá)；免疫組化方法檢測各組斑馬魚腦內(nèi)TH和NR2B受體的表達(dá)。 4.青藤堿及美沙酮對斑馬魚胚胎的心臟毒性研究 收集斑馬魚胚胎,孵育48h。將48hpf的胚胎隨機分組放入24孔板中,每孔8枚胚胎。按預(yù)實驗結(jié)果設(shè)定青藤堿1000、500、300、200、100mg/L濃度組和美沙酮1000、500、300、200、100mg/L濃度組以及胚胎培養(yǎng)液空白對照組,每組取24孔板兩孔共16枚胚胎。按上述濃度進(jìn)行給藥后12h和24h體式顯微鏡下觀察各組胚胎心包及心臟形態(tài),并記錄其心率。整個實驗重復(fù)進(jìn)行3次,每次實驗用同一批斑馬魚胚胎。 5.統(tǒng)計方法 統(tǒng)計結(jié)果均采用x±s的形式表示,采用spss17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理,多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,方差齊時用LSD法,方差不齊時采用Dunnett's T3進(jìn)行檢驗,同組數(shù)據(jù)比較用配對樣本t檢驗。以P0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。 實驗結(jié)果 1.以腹腔注射給藥的方式,各組斑馬魚訓(xùn)練之前在伴藥箱的活動時間無明顯差異(P0.05),而注射嗎啡并進(jìn)行連續(xù)3次訓(xùn)練后,40、50、60μg·g-1嗎啡組斑馬魚在伴藥箱中的活動時間比訓(xùn)練前均明顯增加(P0.05),而40、50gg·g-1嗎啡組斑馬魚在伴藥箱活動時間的差值與生理鹽水組比較有顯著差異(P0.01)。比較斑馬魚5min內(nèi)在伴藥箱中的運動總路程,各組斑馬魚訓(xùn)練前在伴藥箱中的運動路程無明顯差異,而訓(xùn)練后,40、50gg·g-1嗎啡組斑馬魚在伴藥箱中的總路程明顯延長(P0.01),表明腹腔注射40-50gg·g-1嗎啡并對斑馬魚進(jìn)行連續(xù)3次訓(xùn)練能夠誘導(dǎo)其條件性位置偏愛的形成。記錄斑馬魚在CPP箱中的運動軌跡,注射40μg·g-1嗎啡后斑馬魚在非偏愛箱中的運動軌跡明顯增多,而空白組斑馬魚在非偏愛箱中的運動軌跡訓(xùn)練前后無明顯變化。 2.青藤堿干預(yù)嗎啡依賴的斑馬魚后,40μg·g-1嗎啡模型組斑馬魚造模前后在伴藥箱中的活動時間差值與空白組相比,差異具有顯著性意義(P0.05)。而青藤堿高劑量(80μg·g-1)組和美沙酮(40μg·g-1)組訓(xùn)練前后在伴藥箱中的活動時間的差值與模型組相比有顯著性差異；與空白組相比,差異無顯著性意義。 3. q-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組斑馬魚腦內(nèi)μ阿片受體(zfmor)和6阿片受體(zfdorl和zfdor2)的相對表達(dá)量,與空白組相比,均顯著降低(P0.05),表明連續(xù)注射嗎啡能抑制斑馬魚腦內(nèi)阿片受體的表達(dá)。而注射給予斑馬魚美沙酮或不同劑量青藤堿后,發(fā)現(xiàn)80μg·g-1的青藤堿能使斑馬魚腦內(nèi)zfmor、zfdor1、 zfdor2的表達(dá)均上調(diào),與嗎啡模型組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),而40μg·g-1的青藤堿能使zfmor的表達(dá)上調(diào),恢復(fù)成正常水平,但zfdorl和zfdor2的表達(dá)與模型組相比,無顯著性差異。 4.免疫組化結(jié)果表明,模型組斑馬魚腦內(nèi)TH和NR2B蛋白的表達(dá)與空白組相比顯著增加,提示嗎啡通過調(diào)控斑馬魚腦內(nèi)TH和NR2B的水平來誘導(dǎo)成癮。80μg·g-1的青藤堿和美沙酮干預(yù)后,斑馬魚腦內(nèi)TH和NR2B表達(dá)顯著降低,表明青藤堿可能通過抑制斑馬魚腦內(nèi)部分谷氨酸受體及多巴胺受體的表達(dá)來抑制成癮。 5.利用系列劑量美沙酮處理48hdf斑馬魚胚胎后,1000mg/L、500mg/L組斑馬魚胚胎在給藥12h后全部死亡,而300mg/L、200mg/L斑馬魚胚胎也出現(xiàn)部分死亡,存活斑馬魚給藥12h、24h后心率與空白組相比,均顯著降低。100mg/L美沙酮處理40hdf斑馬魚胚胎后,未出現(xiàn)死亡,心率與空白組相比,也無顯著性差異。系列劑量青藤堿處理48hdf斑馬魚胚胎,結(jié)果各劑量組斑馬魚胚胎在給藥后12h、24h心率與空白組相比,差異均無顯著性意義,斑馬魚心臟區(qū)域也未出現(xiàn)心包腫大、心區(qū)淤血堆積等現(xiàn)象,該結(jié)果表明青藤堿對斑馬魚心臟無明顯毒性。 結(jié)論 1.本研究中斑馬魚經(jīng)過連續(xù)3次注射嗎啡(40-50μg·g-1),其訓(xùn)練前后在伴藥箱中的活動差值及運動路程、運動軌跡與空白組相比均明顯增多,表明嗎啡誘導(dǎo)的斑馬魚條件性位置偏愛模型構(gòu)建成功,也證明斑馬魚能夠成功用于藥物依賴方面的研究。 2.青藤堿高劑量組(80μg·g-1)和美沙酮(40μg·g1)干預(yù)均能抑制嗎啡誘導(dǎo)的條件性位置偏愛,使斑馬魚在伴藥箱中停留時間顯著降低,表明美沙酮和高劑量的青藤堿均能有效抑制嗎啡依賴引起的斑馬魚行為學(xué)的變化。而低劑量(40μg·g-1)的青藤堿不能引起嗎啡依賴斑馬魚行為的顯著變化。 3.連續(xù)3次注射嗎啡能使斑馬魚腦內(nèi)zfinor、zfdor1、zfdor2的表達(dá)下調(diào),而青藤堿高劑量(80μg·g-1)和美沙酮(40μg·g-1)的干預(yù)能抑制嗎啡依賴引起的zfinor、zfdor1、zfdor2表達(dá)下調(diào),但是低劑量的青藤堿不能產(chǎn)生明顯的抑制效果。 4.斑馬魚嗎啡依賴也可能與其腦內(nèi)TH和NR2B的表達(dá)改變有關(guān),而青藤堿能夠抑制這種改變從而戒斷毒癮。 5.青藤堿各劑量組處48hdf斑馬魚胚胎后,其給藥后12h、24h心率與空白組相比,均無顯著性變化,表明青藤堿并無明顯的斑馬魚胚胎毒性,正常劑量的青藤堿能夠運用于嗎啡依賴的戒斷。
【關(guān)鍵詞】：斑馬魚 嗎啡 條件性位置偏愛 阿片受體 谷氨酸受體 青藤堿
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R-332;R285.5
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-25
• 第一章 嗎啡誘導(dǎo)的斑馬魚條件性位置偏愛模型的建立25-32
• 1.1 實驗材料25-26
• 1.2 實驗方法26-27
• 1.3 實驗結(jié)果27-30
• 1.4 討論30-32
• 第二章 青藤堿對嗎啡誘導(dǎo)斑馬魚條件性位置偏愛行為及腦內(nèi)相關(guān)受體表達(dá)的影響32-52
• 2.1 實驗材料33-34
• 2.2 實驗方法34-41
• 2.3 實驗結(jié)果41-50
• 2.4 討論50-52
• 第三章 青藤堿和美沙酮對斑馬魚胚胎心臟毒性的初步研究52-57
• 3.1 實驗材料52-53
• 3.2 實驗方法53
• 3.3 結(jié)果53-56
• 3.4 討論56-57
• 第四章 討論57-61
• 本課題創(chuàng)新之處61
• 問題與展望61-62
• 參考文獻(xiàn)62-70
• 綜述70-86
• 參考文獻(xiàn)79-86
• 成果86-87
• 致謝87-88

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：707861