本文關(guān)鍵詞：瘧原蟲高通量分子檢測(cè)法的建立及其在瘧疾根除行動(dòng)中的應(yīng)用

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【摘要】：[研究目的] 雖然瘧疾仍然是世界上最主要的傳染性疾病之一,但是近年來包括中國在內(nèi)的許多國家都已成功的控制了瘧疾在當(dāng)?shù)氐膫鞑�。這就使得瘧疾的根除在這些地區(qū)成為可能。當(dāng)一個(gè)國家或地區(qū)開展瘧疾根治運(yùn)動(dòng)時(shí),該疾病的診斷策略就要從被動(dòng)的診斷單個(gè)患者轉(zhuǎn)為主動(dòng)的篩查所有的潛在感染者,所謂的潛在感染者包括無癥狀表現(xiàn)的患者以及低蟲血率的患者。然而現(xiàn)存的瘧疾診斷方法都無法滿足主動(dòng)篩查疾病時(shí)所需要的高通量以及高靈敏度。在本課題中,我們致力于建立一個(gè)簡便、靈敏、可靠的高通量瘧原蟲檢測(cè)方法,并將該方法應(yīng)用于瘧疾的大規(guī)模主動(dòng)篩查中。 [方法] 我們采用了一個(gè)三明治式的RNA雜交系統(tǒng)直接檢測(cè)惡性瘧和間日瘧病人外周血中存在的瘧原蟲18s rRNA(下稱瘧原蟲18S rRNA雜交檢測(cè)法)。該方法不需要提取或純化RNA,也不需要對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,檢測(cè)過程通過一系列探針雜交完成。這些探針含有兩部分雜交位點(diǎn)：一部分可以跟靶標(biāo)分子特異性結(jié)合；另一部分可以跟固定于固相表面的核酸序列或者信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)中的核酸序列相結(jié)合。瘧原蟲18S rRNA雜交檢測(cè)法采用類似于酶聯(lián)免疫反應(yīng)的檢測(cè)流程在96孔板上進(jìn)行,每例樣品僅需20微升。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證之后,我們使用該方法對(duì)202名瘧疾疫區(qū)不明發(fā)熱病人的臨床血樣進(jìn)行了檢測(cè),并將檢測(cè)結(jié)果與顯微鏡鏡檢、快速診斷試紙條以及熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了平行對(duì)比。 [結(jié)果] 瘧原蟲18S rRNA雜交檢測(cè)法檢出了所有66例顯微鏡鏡檢確診的瘧疾病例,這其中包括59份經(jīng)過反復(fù)凍融過的血樣；該方法還分別在3例顯微鏡鏡檢陰性和4例快速診斷試紙條陰性的樣品中檢測(cè)到了瘧原蟲,這個(gè)結(jié)果與熒光定量PCR的結(jié)果一致。所有瘧原蟲18S rRNA雜交檢測(cè)法判定為陰性的樣品,在另外三種方法中也被判定為陰性。本方法對(duì)于惡性瘧原蟲的檢測(cè)下限為0.04個(gè)每微升。 [結(jié)論] 本課題所設(shè)計(jì)的高通量瘧原蟲檢測(cè)方法流程簡單、靈敏度高,適用于大規(guī)模的瘧疾主動(dòng)篩查。該方法對(duì)于瘧疾傳播率較低的地區(qū)、計(jì)劃或正在開展瘧疾根除運(yùn)動(dòng)的地區(qū)以及面臨輸入型瘧疾威脅的地區(qū)都具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：瘧原蟲 RNA 高通量 篩查
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R382.31
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-6
• 前言6-13
• 實(shí)驗(yàn)材料13-15
• 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材13
• 探針和引物13
• 瘧原蟲蟲株13
• 健康人血樣品13
• 臨床病人血樣的采集13-14
• 主要的儀器設(shè)備14-15
• 實(shí)驗(yàn)方法15-20
• 臨床樣品的顯微鏡檢查15
• 惡性瘧原蟲的體外培養(yǎng)15-16
• 實(shí)驗(yàn)室瘧原蟲采集與計(jì)數(shù)16
• 實(shí)驗(yàn)室干血片的制作16
• 瘧原蟲的18S rRNA雜交檢測(cè)法16-17
• 1. 分子靶標(biāo)的確定16-17
• 2. 樣品裂解暨18S rRNA的釋放及保護(hù)17
• 3. 18S rRNA的檢測(cè)17
• RDT診斷17-18
• DNA的提取及熒光定量PCR18-20
• 結(jié)果20-31
• 瘧原蟲 18S rRNA雜交檢測(cè)法的方法學(xué)驗(yàn)證20-28
• 臨床樣品的檢測(cè)28-31
• 討論31-35
• 結(jié)論35-36
• 附錄36-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 致謝56-57
• 簡歷57-58

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：704820