本文關(guān)鍵詞：副溶血性弧菌免疫檢測(cè)新方法研究

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【摘要】：食源性疾病是目前世界上最為常見(jiàn)、分布最廣的疾病之一，，由致病菌所引起的食源性疾病在國(guó)內(nèi)外都是極為重要的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，近年來(lái)我國(guó)各地區(qū)尤其是沿海地區(qū)因食用副溶血性弧菌污染的水產(chǎn)品所引起的食物中毒已經(jīng)高居微生物性食物中毒的首位。目前已報(bào)道的副溶血性弧菌檢測(cè)方法均各有其優(yōu)缺點(diǎn)，因此有必要不斷探索研發(fā)操作更為便捷、檢測(cè)更為快速、靈敏度更高的新型檢測(cè)方法。本課題對(duì)目前廣泛應(yīng)用的免疫學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行了改進(jìn)，制備、評(píng)價(jià)了針對(duì)副溶血性弧菌表面蛋白的三種抗體探針，并結(jié)合磁分離富集技術(shù)和稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針技術(shù)，建立了針對(duì)副溶血性弧菌的新型免疫檢測(cè)方法。 本文首先通過(guò)基因工程方法，擴(kuò)增得到了副溶血性弧菌鞭毛蛋白FlaA、外膜蛋白OmpU和OmpW的對(duì)應(yīng)編碼基因，分別克隆到pET28a、pET24a質(zhì)粒載體上。將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體pET28a-FlaA、pET24a-OmpW、pET24a-OmpU轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌E.coli BL21（DE3）。然后對(duì)表達(dá)宿主菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并用Ni-NTA resin柱對(duì)三種目標(biāo)蛋白進(jìn)行了純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證得到了單一條帶的抗原蛋白。 其次，分別以副溶血性弧菌滅活菌體、純化的FlaA、OmpU和OmpW蛋白作為抗原對(duì)家兔進(jìn)行免疫，制備多克隆抗血清，并經(jīng)飽和硫酸銨分級(jí)沉淀法純化獲得多克隆抗體。得到純化后效價(jià)為1:160,000的全菌抗體；針對(duì)全菌抗原效價(jià)為1:16000的FlaA抗體、效價(jià)為1:16,000的OmpU抗體、效價(jià)為1:8,000的OmpW抗體。用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)四種抗體的特異性進(jìn)一步量化評(píng)估，全菌抗體與副溶血性弧菌的結(jié)合率為91.57±5.40%；FlaA抗體為89.77±6.89%；OmpU抗體為34.32±2.78%；OmpW抗體為63.53±5.40%。由此選擇全菌抗體、FlaA抗體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)方法的建立。 隨后，采用水熱-溶劑熱方法成功制備了氨基化磁性納米粒子，在最佳初始抗體溶液濃度600μg/mL、反應(yīng)40min條件下將其與全菌抗體組裝成免疫磁珠。同時(shí)采用水熱法制備得到了具有穩(wěn)定、靈敏、可避免生物樣本自發(fā)熒光干擾等優(yōu)點(diǎn)的稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子NaYF_4:Yb,Er，在最佳初始抗體溶液濃度800μg/mL、反應(yīng)60min條件下將其與FlaA抗體組裝成信號(hào)探針。然后將磁珠-全菌抗體與目標(biāo)菌孵育，外加磁場(chǎng)分離后再與UCNPs-FlaA抗體孵育，形成“三明治”夾心型復(fù)合體，980nm激發(fā)測(cè)定其特征熒光峰強(qiáng)度。結(jié)果顯示，在5×10~3-5×10~5cfu/mL范圍內(nèi)，副溶血性弧菌菌落數(shù)與熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=178.25X-506.41（R2=0.9919），檢出限為10~3cfu/mL。在模擬水產(chǎn)品樣品的檢測(cè)中，加標(biāo)回收率為90.7%-96.7%，與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法結(jié)果一致。
【關(guān)鍵詞】：副溶血性弧菌 抗體 免疫分析 磁性納米粒子 稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 第一章 引言9-16
• 1.1 副溶血性弧菌檢測(cè)的意義與方法9-12
• 1.1.1 副溶血性弧菌檢測(cè)的意義9-10
• 1.1.2 副溶血性弧菌的檢測(cè)方法10-12
• 1.2 副溶血性弧菌外膜蛋白的研究進(jìn)展12-13
• 1.3 稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的研究與應(yīng)用13-14
• 1.4 論文的立題意義與研究?jī)?nèi)容14-16
• 1.4.1 論文立題意義14
• 1.4.2 論文主要研究?jī)?nèi)容14-16
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法16-29
• 2.1 材料與主要試劑16-17
• 2.1.1 菌株、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16
• 2.1.2 主要試劑與工具酶16
• 2.1.3 主要溶液的配制16-17
• 2.1.4 主要儀器17
• 2.3 實(shí)驗(yàn)原理17-19
• 2.3.1 抗體與氨基化磁珠連接原理17-18
• 2.3.2 基于磁分離、上轉(zhuǎn)換材料發(fā)光的 V. parahaemolyticus 檢測(cè)方法原理18-19
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法19-29
• 2.4.1 菌株的活化與培養(yǎng)鑒定19
• 2.4.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建19-21
• 2.4.3 外源蛋白表達(dá)與純化21-23
• 2.4.4 動(dòng)物免疫及抗血清制備23-24
• 2.4.5 間接 ELISA 法評(píng)價(jià)抗體24-25
• 2.4.6 免疫磁珠的制備25-26
• 2.4.7 抗體的稀土發(fā)光上轉(zhuǎn)換納米粒子標(biāo)記26-27
• 2.4.8 基于磁分離、上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記的副溶血性弧菌檢測(cè)方法的建立27
• 2.4.9 模擬水產(chǎn)樣品中副溶血性弧菌的檢測(cè)27-29
• 第三章 結(jié)果與討論29-51
• 3.1 副溶血性弧菌 ATCC 17802 菌株的復(fù)蘇及革蘭氏染色鏡檢29
• 3.2 重組表達(dá)載體 pET28a-FlaA、pET24a-OmpU，pET24a-OmpW 的構(gòu)建29-30
• 3.3 目標(biāo)蛋白的表達(dá)與純化30-33
• 3.3.1 FlaA 蛋白的表達(dá)與純化30-31
• 3.3.2 OmpW 蛋白的表達(dá)與純化31-32
• 3.3.3 OmpU 蛋白的表達(dá)與純化32-33
• 3.4 抗體純化33-34
• 3.5 抗體純化前后效價(jià)測(cè)定34-36
• 3.5.1 全菌抗體效價(jià)34-35
• 3.5.2 FlaA 抗體效價(jià)35
• 3.5.3 OmpU 抗體效價(jià)35
• 3.5.4 OmpW 抗體效價(jià)35-36
• 3.6 抗體針對(duì)全菌抗原效價(jià)測(cè)定36
• 3.7 棋盤(pán)滴定法確定抗體、抗原最適工作濃度36-38
• 3.7.1 全菌抗體及 V. parahaemolyticus 抗原最適工作濃度36-37
• 3.7.2 FlaA 抗體及 V. parahaemolyticus 抗原最適工作濃度37
• 3.7.3 OmpU 抗體及 V. parahaemolyticus 抗原最適工作濃度37-38
• 3.7.4 OmpW 抗體及 V. parahaemolyticus 抗原最適工作38
• 3.8 抗體濃度測(cè)定38
• 3.9 敏感性試驗(yàn)38-39
• 3.9.1 全菌抗體敏感性實(shí)驗(yàn)38
• 3.9.2 FlaA 抗體敏感性實(shí)驗(yàn)38-39
• 3.9.3 OmpU 抗體敏感性實(shí)驗(yàn)39
• 3.9.4 OmpW 抗體敏感性實(shí)驗(yàn)39
• 3.10 抗體特異性實(shí)驗(yàn)39-41
• 3.10.1 全菌抗體特異性實(shí)驗(yàn)39-40
• 3.10.2 FlaA 抗體特異性實(shí)驗(yàn)40
• 3.10.3 OmpU 抗體特異性實(shí)驗(yàn)40
• 3.10.4 OmpW 抗體特異性實(shí)驗(yàn)40-41
• 3.11 流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)抗體特異性41-43
• 3.11.1 全菌抗體特異性評(píng)價(jià)41
• 3.11.2 FlaA 抗體特異性評(píng)價(jià)41-42
• 3.11.3 OmpU 抗體特異性評(píng)價(jià)42
• 3.11.4 OmpW 抗體特異性評(píng)價(jià)42-43
• 3.12 磁珠與全菌抗體的結(jié)合與表征43-46
• 3.12.1 氨基化磁珠的表征43-44
• 3.12.2 氨基化磁珠與全菌抗體結(jié)合的表征44-45
• 3.12.3 孵育時(shí)間的優(yōu)化45
• 3.12.4 全菌抗體初始濃度的優(yōu)化45-46
• 3.13 氨基化 UCNPs 與 FlaA 抗體的結(jié)合與表征46-49
• 3.13.1 UCNPs 的表征46-47
• 3.13.2 氨基化 UCNPs 的表征47-48
• 3.13.3 氨基化 UCNPs 與 FlaA 抗體結(jié)合的表征48-49
• 3.13.4 孵育時(shí)間的優(yōu)化49
• 3.13.5 FlaA 抗體初始濃度的優(yōu)化49
• 3.14 副溶血性弧菌的檢測(cè)49-50
• 3.15 模擬水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測(cè)50-51
• 主要結(jié)論與展望51-52
• 致謝52-53
• 參考文獻(xiàn)53-58
• 附錄58

【參考文獻(xiàn)】

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

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本文編號(hào)：704816