本文關(guān)鍵詞：重組百日咳鮑特氏菌腺苷酸環(huán)化酶毒素的特性分析及其檢測方法研究

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【摘要】：百日咳是由百日咳鮑特氏菌（簡稱百日咳桿菌）引起的一種急性呼吸道傳染病，其中尤以嬰幼兒多見。該病原菌在侵襲宿主時能產(chǎn)生百日咳毒素、腺苷酸環(huán)化酶毒素（adenylate cyclase toxin，ACT/CyaA）等多種毒力因子，這些生物活性分子在其致病過程中發(fā)揮著重要作用。ACT屬于細(xì)菌成孔毒素RTX（repeat in toxin）家族的成員之一，其生物活性包括C端（400-1706aa）溶血活性（hemolytic activity）和N端（1-400aa）的腺苷酸環(huán)化酶活性（adenylate cyclase activity)。盡管研究證實ACT蛋白參與百日咳桿菌感染宿主時的免疫調(diào)節(jié)，但其在細(xì)菌感染中的作用機(jī)制還不是完全清楚；此外，現(xiàn)行歐洲藥典明確指出在百日咳疫苗生產(chǎn)中應(yīng)監(jiān)測細(xì)菌毒力因子ACT蛋白，以加強(qiáng)疫苗的質(zhì)量控制，但目前我國并沒有相關(guān)檢測ACT的方法。針對上述研究現(xiàn)狀，本課題應(yīng)用DNA重組技術(shù)，原核表達(dá)并純化重組ACT蛋白，通過基因水平的突變得到不同形式的ACT蛋白，并從細(xì)胞毒性和腺苷酸環(huán)化酶活性兩方面對重組ACT的活性進(jìn)行鑒定，研究分析ACT調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答的功能特性，初步探討其在百日咳感染中的作用機(jī)制；同時應(yīng)用純化重組蛋白制備ACT特異性的單克隆抗體和多克隆抗體，建立檢測ACT的ELISA方法，并對方法進(jìn)行驗證。 一、百日咳桿菌腺苷酸環(huán)化酶毒素的重組表達(dá)和純化 根據(jù)已知的ACT及其修飾蛋白CyaC的基因序列設(shè)計、合成引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將上述兩種目的基因特異性擴(kuò)增產(chǎn)物連接到同一雙表達(dá)質(zhì)粒pETduet-1中；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21（DE3），經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，PCR、酶切和測序鑒定為陽性的克隆，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)ACT和CyaC表達(dá)；采用硫酸銨沉淀法和DEAE離子交換層析法對ACT蛋白進(jìn)行純化。成功構(gòu)建了ACT及其修飾蛋白CyaC的共表達(dá)體系，最終獲得了大量高純度的重組ACT蛋白。純化的重組蛋白進(jìn)行了SDS-PAGE、ELISA和WesternBlot檢測分析，結(jié)果顯示重組ACT與百日咳臨床分離株全菌體免疫小鼠血清以及全細(xì)胞百日咳疫苗免疫血清均存在較強(qiáng)抗原抗體反應(yīng)，同時與共純化無細(xì)胞百日咳疫苗免疫小鼠血清之間存在一定抗原抗體反應(yīng)。應(yīng)用親和層析法對重組蛋白進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素（endotoxin）的去除處理，并通過鱟試驗法對處理前后樣品中殘余的內(nèi)毒素進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示成功去除了重組蛋白中絕大部分的內(nèi)毒素，每微克蛋白中內(nèi)毒素濃度僅為145.5pg。 二、重組腺苷酸環(huán)化酶毒素蛋白特性和功能分析 采用噻唑藍(lán)（thiazolyl blue，MTT）檢測試驗和乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）釋放測定試驗檢測分析重組ACT作用于J774A.1鼠巨噬細(xì)胞的毒性反應(yīng)，同時分析J774A.1細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的變化和BHK21細(xì)胞形態(tài)變化，評價重組ACT的腺苷酸環(huán)化酶活性。結(jié)果顯示ACT作用于J774A.1細(xì)胞后，可引起其細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的上升，并釋放出LDH，表明重組ACT具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性和腺苷酸環(huán)化酶活性，且隨著其濃度的增加，細(xì)胞毒性增強(qiáng)。而突變?nèi)笔佘账岘h(huán)化酶活性的重組ACT蛋白作用相同時間后未檢測到cAMP濃度的上升。此外，ACT蛋白作用于BHK21細(xì)胞能引起該細(xì)胞形態(tài)變化，由典型的兩極化纖維母細(xì)胞形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則的星形，部分細(xì)胞死亡，，也間接表明了本研究制備重組蛋白具有腺苷酸環(huán)化酶活性。為了評價重組ACT的免疫調(diào)節(jié)功能，我們將重組ACT和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）分別單獨刺激和共同刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，采用Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)激酶活化水平，結(jié)果與單獨刺激組比較，共同刺激組的p-NF-κB水平明顯增加，p-p38和p-JNK輕度增加；采用ELISA法檢測細(xì)胞上清中的細(xì)胞因子，結(jié)果共同刺激的細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6和IL-10明顯增多，TNF-α和IL-12明顯減少，與LPS單獨刺激比較，呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.01)。此外，ACT單獨作用也能誘導(dǎo)較高水平的IL-6的分泌，與共同刺激組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。 三、抗ACT抗體的制備及其檢測方法的建立 采用雜交瘤細(xì)胞術(shù)建立了四株分泌抗ACT的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并通過雜交瘤細(xì)胞誘生腹水大量制備了四株ACT特異性的小鼠單克隆抗體，各株腹水效價均在1:104以上。同時經(jīng)多次免疫獲得ACT特異的兔多抗血清。之后分別采用辛酸-硫酸銨沉淀法和蛋白A親和層析法純化單抗和多抗，純化后抗體純度達(dá)90%以上。對抗體進(jìn)行了濃度測定，并采用SDS-PAGE、ELISA、狹縫雜交和Western Blot方法對抗體純度、分子量、抗原特異性和效價等進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示抗體與重組ACT特異性反應(yīng)。篩選了兩株識別不同位點（阻斷抑制率均大于75%）的兩株單抗，矩陣法確定了3F9作為包被抗體，其最佳工作濃度為5μg/ml；而辣根過氧化物酶標(biāo)記的1B8作為檢測抗體，其最佳工作濃度為1:5000倍稀釋，約為2μg/ml。建立的定量檢測ACT的ELISA方法，靈敏度為1.17μg/L；平均批內(nèi)變異系數(shù)（CV）為9.93%，平均批間變異系數(shù)（CV）為10.24%；平均回收率為103.24%；且方法有良好特異性，與百日咳桿菌主要抗原百日咳毒素、百日咳粘附素、絲狀血凝素、凝集原和氣管定植因子均無交叉反應(yīng)。 本研究成功構(gòu)建了ACT及其修飾蛋白CyaC的共表達(dá)體系，并經(jīng)原核表達(dá)和純化獲得了大量較高純度的重組ACT蛋白，為后續(xù)開展ACT相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)；對制備的重組ACT蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)地活性分析，證實了重組ACT具有細(xì)胞毒性和腺苷酸環(huán)化酶活性；ACT能減弱LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-12和TNFα等促進(jìn)免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子能力，而增強(qiáng)其分泌抑制型細(xì)胞因子IL-10的能力，進(jìn)一步驗證了ACT可通過Toll樣受體（Toll-Like Receptor，TLR）介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑影響固有免疫應(yīng)答。實驗室前期研究結(jié)果顯示ACT與TLR通路中的含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白（TIR domain containing adaptor protein，TIRAP）相互作用，這些研究結(jié)果將有助于揭示ACT如何介入TLR途徑，洞悉其調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的具體機(jī)制。此外，本研究獲得了純度和特異性均較好的ACT單克隆和多克隆抗體，并建立了特異、準(zhǔn)確的定量檢測ELISA方法，為加強(qiáng)無細(xì)胞百日咳疫苗的質(zhì)量控制提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：百日咳鮑特氏菌 腺苷酸環(huán)化酶毒素 環(huán)一磷酸腺苷 TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白 單克隆抗體 ELISA
【學(xué)位授予單位】：中國食品藥品檢定研究院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.42
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 縮略詞表10-12
• 前言12-14
• 第一部分 百日咳桿菌腺苷酸環(huán)化酶毒素（ACT）的重組原核表達(dá)和純化14-36
• 材料與方法14-25
• 1.實驗材料14-15
• 2.實驗方法15-25
• 實驗結(jié)果25-32
• 1.目的基因擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建25-26
• 2.目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)26-28
• 3.重組蛋白的純化28-29
• 4.重組蛋白初步鑒定29-31
• 5.重組ACT蛋白中的內(nèi)毒素檢測和去除31-32
• 討論32-35
• 小結(jié)35-36
• 第二部分 ACT 蛋白特性和功能分析36-56
• 材料與方法36-44
• 1.實驗材料36-37
• 2.實驗方法37-44
• 實驗結(jié)果44-52
• 1.重組ACT蛋白細(xì)胞毒性分析44-46
• 2.重組ACT蛋白腺苷酸環(huán)化酶活性分析46-47
• 3.重組ACT蛋白免疫調(diào)節(jié)功能的分析47-52
• 討論52-55
• 小結(jié)55-56
• 第三部分 抗 ACT 抗體的制備和夾心 ELISA 方法的建立56-77
• 材料與方法56-66
• 1.實驗材料56-57
• 2.抗體的制備和鑒定57-63
• 3.夾心ELISA方法的建立和初步驗證63-66
• 實驗結(jié)果66-74
• 1.分泌抗ACT單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立66
• 2.抗ACT單抗的大量制備、純化及特性鑒定66-69
• 3.特異性多克隆抗體的制備、純化和特性鑒定69-70
• 4.夾心ELISA方法的建立和方法學(xué)驗證70-74
• 討論74-76
• 小結(jié)76-77
• 參考文獻(xiàn)77-83
• 綜述83-93
• 參考文獻(xiàn)89-93
• 附錄Ⅰ93-97
• 附錄Ⅱ97-104
• 致謝104-105

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 董秋萍;李濤;熊自忠;;TLR接頭蛋白研究進(jìn)展[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2011年01期

2 張興錄,楊志偉,周軍,于競進(jìn),王克安;我國近年百日咳流行病學(xué)特點分析[J];中國計劃免疫;2000年02期

3 蔡彤;張國來;高華;;第7批細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品的建立[J];中國藥事;2010年09期

4 陶沁,陳圣俊,王華剛,潘家秀,盧青;貴州省1997年局部地區(qū)百日咳爆發(fā)流行給人們的啟示[J];中華流行病學(xué)雜志;1998年06期

本文編號：693093