本文關鍵詞：超敏C反應蛋白單克隆抗體制備及其電化學免疫傳感器的初步研究

  更多相關文章： 超敏CRP 原核表達 單克隆抗體 免疫傳感器 G-四鏈體-hemin-DNA酶

【摘要】：CRP（C-reactive protein,CRP）是由Tillet和Francis在1930首先發(fā)現，相對分子質量為115,000-140,000的血清β球蛋白，因其能與肺炎鏈球菌細胞壁的C多糖起沉淀反應而命名。CRP被認為是一種急性時相反應蛋白，在臨床上常作為急性炎癥與細菌感染的診斷指標。早先基于免疫透射比濁和免疫散射比濁檢測方法僅能檢測到濃度為5mg/L以上的CRP，靈敏度較低。隨著檢測技術的不斷發(fā)展，CRP檢測能力大大提高，利用超敏檢測方法可檢測出低水平(0.1～10mg/L)的CRP濃度，我們稱為超敏CRP(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)。研究表明hs-CRP與AS等心血管疾病的發(fā)生密切相關，被認為是心血管疾病的獨立危險因素。目前，檢測hs-CRP的試劑盒及其關鍵原料-特異高效的抗CRP單克隆抗體主要依賴進口，價格昂貴，不利于臨床推廣。因此，制備特異高效的抗hs-CRP單克隆抗體并建立穩(wěn)定成熟的免疫檢測體系具有良好的社會價值和經濟前景。近年來，基于免疫技術與電化學檢測相結合的免疫傳感器技術也有了長足發(fā)展，其不但能定量分析，而且可能開發(fā)出適合社區(qū)醫(yī)院應用的POCT快速檢測產品，倍受關注。為了提高的生物傳感器靈敏度，國內外一些學者采用不同的標記物來標記抗原或者抗體分子，在標記物中除了最常用的酶以外，G-四鏈體-hemin-DNA酶的研究越來越受到人們的關注，在該類酶的基礎上，開發(fā)了一系列的高靈敏，高特異性的新型傳感器。本研究中，我們制備了抗CRP單克隆抗體并建立起ELISA免疫檢測體系，并在此基礎上進行其電化學免疫傳感器的研究。 主要研究內容與結果 1.重組CRP的原核表達與純化 從NCBI核酸數據庫中獲得人CRP編碼序列進行密碼子偏性改造分析并進行全基因合成，利用E.coli表達系統(tǒng)表達CRP重組蛋白rhCRP28a和rhCRP22b，并經蛋白質濃度檢測，SDS-PAGE鑒定和Western-blot鑒定，結果表明我們所制備的重組蛋白純度大于90%，能與商用抗CRP抗體特異結合，可作為單克隆抗體制備的免疫原，篩選原與免疫檢測的標準品。 2.抗人CRP單克隆抗體的制備及其免疫檢測體系的建立 用我們制備的重組蛋白rhCRP22b作為免疫原免疫Balb/c小鼠，獲得了5株CRP單克隆抗體，篩選得到兩株單克隆抗體2-A6與2-E11可用于hs-CRP的ELISA免疫檢測。通過鑒定兩株抗體效價大于1:2.56×10~5，親和力達到10~9以上。ELISA檢測系統(tǒng)線性范圍為7.2-166ng/ml，靈敏度為5.2ng/ml，批內CV≤6.43%,批間CV≤5.93%，平均回收率為98.9%，與芬蘭Orion公司hs-CRP診斷試劑檢測結果有良好的可比性。 3.超敏CRP電化學免疫傳感器初步研究 使用本實驗室制備的可用于檢測CRP的抗體配對2-A6與2-E11，將G-四鏈體-hemin-DNA酶修飾在二抗2-E11上，并加入DNA的富集步驟，成功制備了用于檢測CRP的夾心式電化學免疫傳感器。并對該免疫傳感器的的線性檢測范圍與特異性進行初步的研究，結果表明該免疫傳感器在0.1pg-100ng/ml的濃度范圍內，電流信號與CRP抗原濃度的對數成正比關系，線性方程為Ia=13.9-1.861lgC（R~2=0.99776），選擇性研究證明該免疫傳感器對所選定的干擾物CEA和AFP無響應，具有較高的靈敏度與特異性，為進一步免疫傳感器的研發(fā)奠定了基礎。
【關鍵詞】：超敏CRP 原核表達 單克隆抗體 免疫傳感器 G-四鏈體-hemin-DNA酶
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• Abstract7-10
• 摘要10-12
• 第一章 前言12-16
• 1.1 選題緣由12
• 1.2 研究背景12-13
• 1.3 研究意義13-14
• 1.4 研究內容14-15
• 1.5 研究方法15-16
• 第二章 CRP 的原核表達、純化與鑒定16-29
• 2.1 材料與方法16-22
• 2.2 結果22-28
• 2.3 討論28-29
• 第三章 抗 CRP 單克隆抗體的制備、鑒定及其免疫檢測體系的初步建立和評價29-40
• 3.1 材料與方法29-35
• 3.2 結果35-38
• 3.3 討論38-40
• 第四章 CRP 電化學免疫傳感器的初步研究40-46
• 4.1 材料與方法40-42
• 4.2 結果42-44
• 4.3 討論44-46
• 全文總結46-47
• 參考文獻47-50
• 文獻綜述50-56
• 參考文獻54-56
• 攻讀學位期間的研究成果56-57
• 致謝57

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前8條

1 張德煒;;高敏C-反應蛋白的研究現狀及臨床意義[J];國際醫(yī)藥衛(wèi)生導報;2006年04期

2 周建華;C-反應蛋白檢測的臨床價值[J];國外醫(yī)學.臨床生物化學與檢驗學分冊;2004年02期

3 王波;王發(fā)斌;張延威;孟澤彬;牛延慧;;單克隆抗體研究進展[J];北方藥學;2012年08期

4 王臨光;王海波;付強;李先進;;急性冠脈綜合癥診斷中檢測心肌肌鈣蛋白I肌紅蛋白及肌酸激酶同工酶及超敏C-反應蛋白的意義[J];河北醫(yī)學;2006年01期

5 車瑩;李校X;胡培聲;顏江華;姚娜;蔡琳;林紹強;王生育;朱佳男;;重組人堿性成纖細胞生長因子單克隆抗體的制備、鑒定及初步應用[J];免疫學雜志;2011年06期

6 向軍儉;童吉宇;王宏;;抗體技術研究進展(1):人源抗體技術[J];暨南大學學報(自然科學與醫(yī)學版);2012年05期

7 子建文;趙黎明;;急性盆腔炎患者CRP、IL-2及T細胞亞群測定的臨床意義[J];西南國防醫(yī)藥;2009年02期

8 繆璐;劉仲明;張水華;;電化學免疫傳感器的研究進展[J];中國醫(yī)學物理學雜志;2006年02期

，

本文編號：689147