本文關(guān)鍵詞：超敏C反應(yīng)蛋白單克隆抗體制備及其電化學(xué)免疫傳感器的初步研究

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【摘要】：CRP（C-reactive protein,CRP）是由Tillet和Francis在1930首先發(fā)現(xiàn)，相對(duì)分子質(zhì)量為115,000-140,000的血清β球蛋白，因其能與肺炎鏈球菌細(xì)胞壁的C多糖起沉淀反應(yīng)而命名。CRP被認(rèn)為是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在臨床上常作為急性炎癥與細(xì)菌感染的診斷指標(biāo)。早先基于免疫透射比濁和免疫散射比濁檢測(cè)方法僅能檢測(cè)到濃度為5mg/L以上的CRP，靈敏度較低。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，CRP檢測(cè)能力大大提高，利用超敏檢測(cè)方法可檢測(cè)出低水平(0.1～10mg/L)的CRP濃度，我們稱為超敏CRP(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)。研究表明hs-CRP與AS等心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，被認(rèn)為是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。目前，檢測(cè)hs-CRP的試劑盒及其關(guān)鍵原料-特異高效的抗CRP單克隆抗體主要依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴，不利于臨床推廣。因此，制備特異高效的抗hs-CRP單克隆抗體并建立穩(wěn)定成熟的免疫檢測(cè)體系具有良好的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)前景。近年來，基于免疫技術(shù)與電化學(xué)檢測(cè)相結(jié)合的免疫傳感器技術(shù)也有了長(zhǎng)足發(fā)展，其不但能定量分析，而且可能開發(fā)出適合社區(qū)醫(yī)院應(yīng)用的POCT快速檢測(cè)產(chǎn)品，倍受關(guān)注。為了提高的生物傳感器靈敏度，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者采用不同的標(biāo)記物來標(biāo)記抗原或者抗體分子，在標(biāo)記物中除了最常用的酶以外，G-四鏈體-hemin-DNA酶的研究越來越受到人們的關(guān)注，在該類酶的基礎(chǔ)上，開發(fā)了一系列的高靈敏，高特異性的新型傳感器。本研究中，我們制備了抗CRP單克隆抗體并建立起ELISA免疫檢測(cè)體系，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行其電化學(xué)免疫傳感器的研究。 主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果 1.重組CRP的原核表達(dá)與純化 從NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得人CRP編碼序列進(jìn)行密碼子偏性改造分析并進(jìn)行全基因合成，利用E.coli表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CRP重組蛋白rhCRP28a和rhCRP22b，并經(jīng)蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)，SDS-PAGE鑒定和Western-blot鑒定，結(jié)果表明我們所制備的重組蛋白純度大于90%，能與商用抗CRP抗體特異結(jié)合，可作為單克隆抗體制備的免疫原，篩選原與免疫檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品。 2.抗人CRP單克隆抗體的制備及其免疫檢測(cè)體系的建立 用我們制備的重組蛋白rhCRP22b作為免疫原免疫Balb/c小鼠，獲得了5株CRP單克隆抗體，篩選得到兩株單克隆抗體2-A6與2-E11可用于hs-CRP的ELISA免疫檢測(cè)。通過鑒定兩株抗體效價(jià)大于1:2.56×10~5，親和力達(dá)到10~9以上。ELISA檢測(cè)系統(tǒng)線性范圍為7.2-166ng/ml，靈敏度為5.2ng/ml，批內(nèi)CV≤6.43%,批間CV≤5.93%，平均回收率為98.9%，與芬蘭Orion公司hs-CRP診斷試劑檢測(cè)結(jié)果有良好的可比性。 3.超敏CRP電化學(xué)免疫傳感器初步研究 使用本實(shí)驗(yàn)室制備的可用于檢測(cè)CRP的抗體配對(duì)2-A6與2-E11，將G-四鏈體-hemin-DNA酶修飾在二抗2-E11上，并加入DNA的富集步驟，成功制備了用于檢測(cè)CRP的夾心式電化學(xué)免疫傳感器。并對(duì)該免疫傳感器的的線性檢測(cè)范圍與特異性進(jìn)行初步的研究，結(jié)果表明該免疫傳感器在0.1pg-100ng/ml的濃度范圍內(nèi)，電流信號(hào)與CRP抗原濃度的對(duì)數(shù)成正比關(guān)系，線性方程為Ia=13.9-1.861lgC（R~2=0.99776），選擇性研究證明該免疫傳感器對(duì)所選定的干擾物CEA和AFP無響應(yīng)，具有較高的靈敏度與特異性，為進(jìn)一步免疫傳感器的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：超敏CRP 原核表達(dá) 單克隆抗體 免疫傳感器 G-四鏈體-hemin-DNA酶
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• Abstract7-10
• 摘要10-12
• 第一章 前言12-16
• 1.1 選題緣由12
• 1.2 研究背景12-13
• 1.3 研究意義13-14
• 1.4 研究?jī)?nèi)容14-15
• 1.5 研究方法15-16
• 第二章 CRP 的原核表達(dá)、純化與鑒定16-29
• 2.1 材料與方法16-22
• 2.2 結(jié)果22-28
• 2.3 討論28-29
• 第三章 抗 CRP 單克隆抗體的制備、鑒定及其免疫檢測(cè)體系的初步建立和評(píng)價(jià)29-40
• 3.1 材料與方法29-35
• 3.2 結(jié)果35-38
• 3.3 討論38-40
• 第四章 CRP 電化學(xué)免疫傳感器的初步研究40-46
• 4.1 材料與方法40-42
• 4.2 結(jié)果42-44
• 4.3 討論44-46
• 全文總結(jié)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 文獻(xiàn)綜述50-56
• 參考文獻(xiàn)54-56
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果56-57
• 致謝57

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：689147