本文關(guān)鍵詞：登革病毒復制子載體的構(gòu)建及其功能鑒定

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【摘要】：登革病毒(dengue virus, DENV)隸屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)病毒,是一類經(jīng)蚊媒傳播的、有包膜的RNA病毒。我國境內(nèi)幾乎每年都有數(shù)百例感染登革病毒的病例報告,該病毒可使人和動物患病,其感染特點是患病率高但治愈率卻比較低,人感染后易給人帶來一些嚴重的后遺癥,嚴重威脅人類健康。且登革類疾病臨床上也缺乏有效的抗病毒藥物,因此該類病毒感染的早期診斷及新型疫苗研發(fā)對有效控制登革類黃病毒疫情的傳播尤為重要。已有研究結(jié)果表明,以登革等黃病毒基因組RNA為基礎的復制子載體技術(shù)已廣泛用于新型疫苗研發(fā)、抗病毒藥物篩選等應用研究領(lǐng)域,在病毒復制和翻譯的調(diào)控分子機制等基礎研究也得到了廣泛的應用。 登革病毒的基因組長約11kb,屬于包膜的單股正鏈RNA病毒,由5’和3’非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)及中間單一的開放讀碼框組成(open reading frame,ORF),其中開放讀碼框編碼三個結(jié)構(gòu)蛋白(C. prM/M、E)和七個非結(jié)構(gòu)蛋白(NSI、NS2A、 NS2B、 NS3、 NS4A、 NS4B和NS5)。結(jié)構(gòu)蛋白主要參與病毒的組裝過程,非結(jié)構(gòu)蛋白及5’和3’UTR在病毒RNA的復制和翻譯的起始及調(diào)控起重要作用。RNA復制子基于相應病毒全長感染性克隆技術(shù),將病毒復制和翻譯必不可少的重要順式作用元件(包括5’和3’UTR、全部病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因和部分必要的病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因)保留,其缺失了大部分結(jié)構(gòu)蛋白基因或由外源基因替代構(gòu)構(gòu)建的病毒復制子。本研究在登革病毒4型感染性cDNA克隆p4上刪除病毒大部分結(jié)構(gòu)基因prM-E,構(gòu)建了登革病毒復制子載體p4-△prME。為驗證復制子載體的包裝功能,將紅色蛋白報告基因mCherry克隆至復制子載體p4-△prME構(gòu)建工程載體p4-△prME-mCherry,同時構(gòu)建缺失RNA依賴RNA聚合酶(RDRP)核心序列GDD的缺陷型復制子載體p4-△prME-mCherry-△GDD。體外轉(zhuǎn)錄和細胞轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果顯示,源自p4-△prME-mCherry的轉(zhuǎn)錄體RNA轉(zhuǎn)染Vero細胞后可持續(xù)呈現(xiàn)特異性的紅色熒光,且在轉(zhuǎn)染后24h-96h可形成穩(wěn)定的信號峰。與之相比,缺失RDRP核心序列GDD的缺陷型復制子載體在轉(zhuǎn)染細胞后無特異紅色熒光出現(xiàn)。以上研究結(jié)果表明,我們所構(gòu)建復制子載體p4-△prME可成功表達紅色熒光蛋白報告基因,這為目標基因表達、重組病毒顆粒制備等奠定了基礎。 RNA型復制子載體的啟動子為原核啟動子T7、SP6等,在實際應用過程中需要進行體外轉(zhuǎn)錄操作,但是體外轉(zhuǎn)錄試劑盒有操作繁瑣且價格昂貴等缺點。相比而言,質(zhì)粒DNA型復制子載體可通過真核啟動子(如CMV、SV40等)在宿主細胞內(nèi)啟動載體的轉(zhuǎn)錄,因此,質(zhì)粒DNA型復制子載體無需像RNA型復制子載體的體外轉(zhuǎn)錄,而是可將復制子載體導入細胞中,從而高效穩(wěn)定表達外源基因。鑒于此,本研究以登革病毒4型感染性克隆p4質(zhì)粒為基礎,將改造后的病毒復制和翻譯必需的順式作用元件和NS5的部分關(guān)鍵序列插入真核表達載體pcDNA3.1(+)的CMV啟動子下游,構(gòu)建了DNA型微復制子載體pcDEN-△prME。為驗證微復制子載體的包裝功能,將定性的綠色熒光蛋白報告基因和定量的海腎熒光素酶基因分別克隆至pcDEN-△prME構(gòu)建工程載體pcDEN-△prME-EGFP和pcDEN-△prME-GLUC。轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果顯示,微復制子載體可成功表達綠色熒光蛋白報告基因及海腎熒光素酶報告基因。 本研究以登革病毒4型感染性cDNA克隆p4為分子基礎,分別構(gòu)建了RNA型復制子載體p4-△prME和DNA型微復制子載體pcDEN-△prME,兩者均可成功表達報告基因等外源基因。尤其是DNA型微復制子載體在保留病毒必要的順式作用元件和NS5部分關(guān)鍵序列的同時缺失了大部分非結(jié)構(gòu)基因,使得該載體在簡化實驗操作的同時大大提高了病毒載體的容量。以上登革病毒復制子載體的構(gòu)建為深入研究以登革為代表黃病毒抗病毒藥物篩選和新型疫苗研發(fā)提供了有力工具,更為病毒復制及翻譯的分子調(diào)控機制提供了新的技術(shù)平臺。
【關(guān)鍵詞】：登革病毒 復制子載體 報告基因
【學位授予單位】：北京化工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R373.33
【目錄】：

• 學位論文數(shù)據(jù)集3-4
• 摘要4-7
• ABSTRACT7-15
• 符號說明15-17
• 第一章 緒論17-23
• 1.1 引言17
• 1.2 登革病毒復制子載體的構(gòu)建17-18
• 1.3 登革病毒復制子載體的應用18-20
• 1.4 研究目的與研究內(nèi)容20-23
• 第二章 登革病毒RNA復制子載體的構(gòu)建及鑒定23-47
• 2.1 材料24-25
• 2.1.1 菌株、質(zhì)粒及細胞24
• 2.1.2 試劑及工具酶24
• 2.1.3 主要試劑配制24
• 2.1.4 主要儀器設備24-25
• 2.2 實驗方法25-40
• 2.2.1 缺失prM-E基因的登革病毒RNA型復制子載體的構(gòu)建25-31
• 2.2.2 構(gòu)建含有紅色報告基因mCherry的登革病毒RNA型復制子載體31-34
• 2.2.3 構(gòu)建缺失GDD基序的含有報告基因的登革病毒RNA型缺陷型復制子載體1834-38
• 2.2.4 登革病毒RNA型復制子載體的功能鑒定38-40
• 2.3 結(jié)果與分析40-44
• 2.3.1 構(gòu)建缺失prM-E基因的登革病毒RNA型復制子載體40-41
• 2.3.2 構(gòu)建含有紅色熒光蛋白mCherry報告基因的登革病毒RNA型復制子載體41-42
• 2.3.3 構(gòu)建缺失GDD基序的含有報告基因的登革病毒RNA型缺陷型復制子載體42-43
• 2.3.4 登革病毒RNA型復制子載體的功能鑒定43-44
• 2.4 討論44-47
• 第三章 登革病毒DNA型微復制子的構(gòu)建及鑒定47-71
• 3.1 材料47-49
• 3.1.1 菌株、質(zhì)粒及細胞47
• 3.1.2 試劑及工具酶47-48
• 3.1.3 主要試劑配制48
• 3.1.4 主要儀器設備48-49
• 3.2 實驗方法49-64
• 3.2.1 構(gòu)建登革病毒DNA型微復制子載體49-56
• 3.2.2 構(gòu)建EGFP報告基因標記的登革病毒DNA型微復制子載體56-59
• 3.2.3 構(gòu)建GLUC報告基因標記的登革病毒DNA型微復制子載體59-62
• 3.2.4 報告基因標記的登革病毒DNA型微復制子載體的鑒定62-64
• 3.3 結(jié)果與分析64-69
• 3.3.1 登革病毒DNA型微復制子載體的構(gòu)建策略64
• 3.3.2 登革病毒DNA型微復制子載體的構(gòu)建及鑒定64-65
• 3.3.3 報告基因標記的登革病毒DNA型微復制子載體的構(gòu)建策略65-67
• 3.3.4 報告基因標記的登革病毒DNA型微復制子載體的構(gòu)建及鑒定67-68
• 3.3.5 登革病毒DNA型微復制子載體功能的定性檢測68-69
• 3.3.6 登革病毒DNA型微復制子載體功能的定量檢測69
• 3.4 討論69-71
• 第四章 結(jié)論71-73
• 參考文獻73-79
• 致謝79-81
• 研究成果及發(fā)表的論文81-83
• 作者簡介83
• 導師簡介83-84
• 附件84-85

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 李曉峰;秦鄂德;;蟲媒黃病毒基因組復制的分子機制研究進展[J];軍事醫(yī)學科學院院刊;2007年01期

2 于學東;秦成峰;姜濤;陳水平;鄧永強;劉然;趙慧;李曉峰;朱武洋;于曼;秦鄂德;;含有海腎螢光素酶報告基因的登革4型病毒亞基因組復制子的構(gòu)建[J];軍事醫(yī)學科學院院刊;2008年02期

3 劉志文;俞永新;張海林;王志偉;賈麗麗;章域震;董關(guān)木;張云;;乙型腦炎減毒活疫苗病毒SA14-14-2株經(jīng)三帶喙庫蚊胸腔接種后的生物學和分子生物學特性[J];中國生物制品學雜志;2007年06期

4 魏榮,王志亮;美國西尼羅病毒感染的實驗室診斷進展[J];中華微生物學和免疫學雜志;2004年02期

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本文編號：688805