本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細胞Toll樣受體4激活對B細胞活化因子的影響

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【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMMSC)在其Toll樣受體(Toll like receptor, TLR)激活狀態(tài)下,可以分化為兩種亞型MSC1和MSC2。MSC1型指骨髓間充質(zhì)干細胞的TLR4激活后其可以增高表達促進T淋巴細胞功能的分子,而TLR3激活后的MSC即MSC2型可以產(chǎn)生抑制T淋巴細胞免疫反應(yīng)的因子。BMMSC在不同TLRs激活下分別具有促進或者抑制T淋巴細胞免疫功能的能力逐漸引起關(guān)注,并且TLRs激活后是否會影響B(tài)MMSC對B淋巴細胞功能相關(guān)的研究比較少。本課題主要研究了人和小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的不同種類的TLRs激活后對其產(chǎn)生的B淋巴細胞活化分子(B cell-activating factor belonging to the TNF family, BAFF)的影響。研究發(fā)現(xiàn)人和小鼠的BMMSC的TLR4激活可以增高BAFF的表達,而TLR2和TLR3則對BAFF的表達沒有影響,且該現(xiàn)象與MSC1和MSC2亞型分別具有的對免疫系統(tǒng)不同的作用相一致。并且NF-ΚB, p38 MAPK和JNK三條通路均參與了BAFF的產(chǎn)生。骨髓間充質(zhì)干細胞特定的TLRs激活后可以產(chǎn)生促進B淋巴細胞功能的因子,可以進一步研究BMMSC的促免疫功能及特定亞群,以便可以更好地應(yīng)用于治療免疫相關(guān)的疾病中。第一部分人和小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng)、特性鑒定目的 分離、培養(yǎng)人和小鼠BMMSC,并鑒定其多向分化能力以及免疫表型方法 分別用密度梯度離心法和貼壁細胞篩選法分離人和小鼠原代骨髓間充質(zhì)干細胞,取P3-P5代細胞。用成脂肪培養(yǎng)基持續(xù)誘導14天,倒置顯微鏡觀察拍照,并用油紅O染色檢測其脂滴的形成。用成骨細胞培養(yǎng)基誘導21天后倒置顯微鏡觀察拍照,并用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)檢測其誘導結(jié)果。用流式細胞術(shù)鑒定其表面分子標志。結(jié)果 人和小鼠BMMSC在培養(yǎng)第14天左右細胞達90%融合,呈長梭形渦樣生長。人和小鼠BMMSC誘導第14天油紅O染色顯示胞漿內(nèi)的脂滴被染成亮紅色。人和小鼠BMMSC成骨誘導第21天后可檢測到胞質(zhì)中含較多紫藍色堿性粒酸酶顆粒。流式細胞術(shù)檢測P3代小鼠BMMSC細胞表面標志分子,結(jié)果顯示小鼠BMMSC弱陽性表達CD106,強陽性表達Sca-1 (stem cell antigen-1)、CD44,并且不表達血細胞的標志CD34、CD45、CD31。同樣的方法檢測P3代人BMMSC細胞表面標志,結(jié)果顯示人BMMSC均高表達CD90、CD44、CD105,而不表達血細胞的標志CD34、CD45、CD31。第二部分TLR2和TLR4對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞多向分化能力影響的比較目的 研究TLR2和TLR4對小鼠BMMSC的多向分化能力的影響。方法 用zymosan作為TLR2的激動劑,LPS作為TLR4的激動劑。分別誘導小鼠BMMSC成脂肪和成骨分化,每兩天換液一次,換液同時分別加上述TLRs激動劑(1μg/ml)。并分別于誘導后14天、21天檢測其成脂,成骨分化效果。結(jié)果 誘導同時加TLRs激動劑的實驗組在誘導第14天用油紅O染色檢測,胞漿內(nèi)的脂滴被染成亮紅色。誘導同時加TLRs激動劑的BMMSC在成骨誘導第21天可檢測到胞質(zhì)中含較多紫色堿性磷酸酶陽性顆粒。TLR2和TLR4激活均不影響小鼠BMMSC的成脂和成骨分化能力。第三部分TLR2, TLR3, TLR4對人和小鼠間充質(zhì)千細胞B細胞激活因子(BAFF)表達的影響及其作用機制探討目的 研究TLR2, TLR3,和TLR4激活對人和小鼠BMMSCB細胞激活因子(BAFF)的產(chǎn)生的影響及其作用機制。方法 先用0,0.1μg/ml,0.5μg/ml,1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml濃度的LPS作用于小鼠BMMSC48小時。用zymosan, LPS (1μg/ml)分別刺激小鼠BMMSC 48小時。用zymosan, Poly(I:C), LPS (1μg/ml)分別刺激人BMMSC48小時。用封閉實驗驗證TLRs受體的作用,分別使用TLR2,和TLR4的封閉抗體anti-TLR2和anti-TLR4以2μg/ml的濃度37-C分別作用30分鐘,接著分別用TLR2和TLR4的激動劑分別刺激48小時后檢測BAFF的表達。用三種TLR4通路的抑制劑PDTC (Pyrrolidinedithiocarbamic acid, NF-κB通路抑制劑),SP600125(JNK通路抑制劑),SB203580(p38 MAPK通路抑制劑),以1μM的濃度37-C分別作用30分鐘,接著用LPS作用(1μg/ml)刺激48小時,用real time PCR和western blot檢測上述幾組細胞的BAFF的表達。用免疫熒光法觀察NF-κB通路激活后該蛋白的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。結(jié)果BAFF的表達并不完全是劑量依賴性增高,當LPS的作用濃度為1μg/ml時小鼠BMMSC的BAFF表達最高。小鼠BMMSC的TLR4激活后,BAFF表達上升2-3倍(p0.05),而TLR2激動劑作用后,BAFF表達只有少量上升(p0.05)。人BMMSC的TLR4激活后,BAFF表達上升2-3倍(p0.05),而TLR3和TLR2激動劑作用后只有微量上升,且沒有統(tǒng)計學意義。TLR4封閉后BAFF下降了53.2±12.2%(p0.05)。NF-κB, JNK通路和p38 MAPK通路抑制后BAFF表達比TLR4激活分別下降了90.4±2.4%,87.0±7.2% and 97.9±4.8%。綜上所述,本研究(1)鑒定了分離的人和小鼠原代BMMSC的特性。(2)選用zymosan和LPS分別作為TLR2和TLR4的激動劑,二者均不影響小鼠BMMSC的成骨,成脂分化能力。(3)小鼠和人BMMSC的TLR4通路激活后,其BAFF的表達增高了2-3倍。而TLR2和TLR,3激活后沒有影響B(tài)AFF的表達。(4),JNK通路,NF-κB通路和p38 MAPK三條通路均參與了BAFF的產(chǎn)生過程。(5)TLR4通路激活后,NF-κB通路有核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細胞 促免疫功能 LPS TLR4 BAFF
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-12
• 第一部分 人和小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng)、特性鑒定12-20
• 材料和方法12-15
• 結(jié)果15-19
• 討論19-20
• 第二部分 TLR2和TLR4對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞多向分化能力的影響20-24
• 材料和方法20-21
• 結(jié)果21-23
• 討論23-24
• 第三部分 TLR2,TLR3,TLR4對人和小鼠間充質(zhì)干細胞B細胞激活因子(BAFF)表達的影響及其內(nèi)在機制探討24-39
• 材料和方法24-29
• 結(jié)果29-35
• 討論35-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻40-43
• 致謝43-44
• 附錄44-46
• 附錄1 英文縮略語44-45
• 附錄2 碩士期間發(fā)表的文章45-46
• 綜述46-54
• 參考文獻52-54

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本文編號：678911