本文關(guān)鍵詞：EGFP示蹤兔BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的實驗研究

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【摘要】：目的采用脂質(zhì)體法將含增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescentprotein，EGFP）基因的MmiR3407-MR03重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived stroma cells，BMSCs）得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP基因的BMSCs系，再用睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）定向誘導(dǎo)分化，以探討EGFP基因標(biāo)記對兔BMSCs體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞等生物學(xué)特性的影響，以期為BMSCs的體內(nèi)移植提供有效的示蹤方法。 方法選用新生新西蘭白兔，取其骨髓用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法進行細(xì)胞原代培養(yǎng)，通過傳代將BMSCs擴增純化。采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測兔BMSCs的CD34、CD44、CD54抗體的表達(dá)情況。按照高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒說明書提取質(zhì)粒DNA。確定G418的最佳篩選濃度后選取第3-5代兔BMSCs，采用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法進行轉(zhuǎn)染，并計算轉(zhuǎn)染效率。G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFP基因的兔BMSCs，并觀察細(xì)胞生長情況。取第3-5代的EGFP-BMSCs和第3-5代的BMSCs，，分為四組：EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組、BMSCs誘導(dǎo)組、EGFP-BMSCs空白組和BMSCs空白組。EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組、BMSCs誘導(dǎo)組均先用10ng/mlbFGF預(yù)誘導(dǎo)24h，再用10ng/mlCNTF誘導(dǎo)12h；EGFP-BMSCs空白組和BMSCs空白組均無特殊處理。觀察四組細(xì)胞形態(tài)變化，采用MTT法檢測四組細(xì)胞活性，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測四組細(xì)胞的巢蛋白（nestin）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NES)的表達(dá)情況，并比較兩誘導(dǎo)組之間、兩空白組之間及各細(xì)胞誘導(dǎo)前后組之間細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞活力及神經(jīng)元特異性標(biāo)記物陽性細(xì)胞率。 結(jié)果 1.原代兔BMSCs貼壁生長，多呈紡錘形，漩渦樣生長。傳代后細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于一致，以梭形為主，胞體飽滿，排列更加有序。傳至10代，細(xì)胞逐漸老化。 2.免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定結(jié)果顯示所培養(yǎng)細(xì)胞的CD44, CD54呈陽性表達(dá)，而CD34表達(dá)呈陰性，符合BMSCs的免疫表型特點。 3.脂質(zhì)體介導(dǎo)含EGFP基因的MmiR3407-MR03質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs后，轉(zhuǎn)染12h，熒光顯微鏡下可觀察到少量細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，轉(zhuǎn)染48h時轉(zhuǎn)染率最高，近30%，之后72h內(nèi)隨時間變化不大。經(jīng)G418篩選后可得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP的BMSCs系。 4.CN TF誘導(dǎo)12h后，可見細(xì)胞胞體伸出2個或多個細(xì)長突起，折光性強，類似神經(jīng)元形態(tài)，熒光顯微鏡下仍可見明亮的綠色熒光。MTT法結(jié)果顯示：24h、48h和72h BMSCs誘導(dǎo)組、EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組、EGFP-BMSCs空白組、BMSCs空白組的OD值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）； 5.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組的NSE陽性細(xì)胞率、nestin陽性細(xì)胞率分別為（49.983.07）%、（48.741.32）%；BMSCs誘導(dǎo)組的NSE陽性細(xì)胞率、nestin陽性細(xì)胞率分別為（48.443.97）%、（47.861.68）%；EGFP-BMSCs空白組和BMSCs空白組的NSE、nestin陽性細(xì)胞率均較小。EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組、BMSCs誘導(dǎo)組兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；EGFP-BMSCs空白組和BMSCs空白組兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；BMSCs誘導(dǎo)組、BMSCs空白組兩組間差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；EGFP-BMSCs誘導(dǎo)組、EGFP-BMSCs空白組兩組間差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論 1.通過脂質(zhì)體法可得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP的兔BMSCs系，EGFP基因標(biāo)記可能為BMSCs移植提供一種有效的示蹤方法； 2.EGFP基因標(biāo)記的兔BMSCs可誘導(dǎo)分化分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，其生物學(xué)特性無影響； 3.睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)后穩(wěn)定表達(dá)EGFP的兔BMSCs可定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 增強型綠色熒光蛋白 神經(jīng)元樣細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【目錄】：

• 主要英文縮略語索引4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-13
• 材料13-17
• 第一部分 兔 BMSCs 體外培養(yǎng)及 EGFP 基因轉(zhuǎn)染的研究17-26
• 方法17-22
• 結(jié)果22-26
• 第二部分 EGFP 標(biāo)記的 BMSCs 向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的影響26-32
• 方法26-28
• 結(jié)果28-32
• 討論32-36
• 結(jié)論36
• 本研究創(chuàng)新性的自我評價36-37
• 參考文獻(xiàn)37-41
• 綜述41-47
• 參考文獻(xiàn)45-47
• 讀研究生期間發(fā)表的論文47-48
• 致謝48

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