本文關(guān)鍵詞：新生大鼠骨骼肌肌源性干細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)和鑒定

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【摘要】：目的：肌源性干細(xì)胞（muscle derived-stem cells，MDSCs）移植治療壓力性尿失禁（SUI）的研究深受關(guān)注，傳統(tǒng)的治療方法長期療效不理想且并發(fā)癥多，隨干細(xì)胞研究的深入，干細(xì)胞移植成為肌肉組織損傷修復(fù)的一種重要手段，同時也為SUI的根本治療帶來希望。其中MDSCs倍受關(guān)注，它是肌肉中一種高度未分化的多潛能干細(xì)胞，具有體外分裂增殖快、自我更新、多向分化潛能和移植后存活率高等特點。并且取材資源豐富，操作方便，安全性高，是一種理想的種子細(xì)胞。由于肌肉組織中MDSCs數(shù)量少，所以MDSCs的分離和體外培養(yǎng)是進(jìn)行移植的關(guān)鍵。本實驗運用改良酶消化法和差速貼壁法分離純化出MDSCs，通過細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行鑒定，并對其體外培養(yǎng)進(jìn)行密切觀察，掌握穩(wěn)定的分離純化和培養(yǎng)方法，為將來移植治療SUI提供重要的實驗依據(jù)。 方法： 1骨骼肌細(xì)胞的消化分離：實驗動物為清潔級新生SD（Sprayue-Dawley）大鼠，雌雄不限。75%酒精浸泡窒息處死后，取下四肢骨骼肌并剪成碎塊（約1mm~3），PBS緩沖液吹打沖洗，靜置后去除上清液，加入約2倍體積的混合酶（2.4u/ml Dispase II、0.5%I型膠原酶，2.5mmol/L CaCl2），37℃水浴箱消化約1小時，加入生長培養(yǎng)基終止消化，過濾后離心棄上層液，重懸細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)（37℃，5%CO2）。 2MDSCs的分離、純化和培養(yǎng)：培養(yǎng)2小時后貼壁細(xì)胞記為PP1，將上層液中未貼壁的細(xì)胞吸出后繼續(xù)培養(yǎng)。24小時后，貼壁細(xì)胞記為PP2。每24小時進(jìn)行差速貼壁培養(yǎng)，直到獲得PP6。PP6培養(yǎng)3天后換液，每2~3天換液1次，待70~80%融合后傳代培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，加入胎牛血清終止消化，按1:2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 3MDSCs生長曲線的測定：取MDSCs傳代培養(yǎng)的一代、四代和七代細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，以3×10~4個/ml的密度接種于24孔培養(yǎng)板，每日隨機(jī)選取3孔進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，共記錄8日，取平均值繪制細(xì)胞生長曲線。 4MTT比色法觀察不同接種密度對MDSCs生長的影響：取MDSCs傳代細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度分別為2、4、6、8、10、12、15×10~5個/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48小時后，每孔加入20ulMTT（5mg/ml），37℃避光培養(yǎng)4小時后棄上清液，每孔加入100ul二甲基亞砜（DMSO），振蕩10分鐘使結(jié)晶物完全溶解，在490nm處檢測吸光度值。 5MDSCs的鑒定：對獲取的MDSCs（PP6）以及MDSCs傳一代、四代、七代進(jìn)行Desmin、Sca-1抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色，對PP1~PP6進(jìn)行Desmin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，以成纖維細(xì)胞作為陰性對照，在顯微鏡下觀察，以胞膜和/或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽性，每組選取不同的視野進(jìn)行計算陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。 6統(tǒng)計學(xué)處理：使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：1MDSCs的消化、分離、純化和細(xì)胞形態(tài) 骨骼肌經(jīng)過混合酶消化后得到肌纖維碎片、骨骼肌細(xì)胞、血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等的混合物，用差速貼壁法將快速貼壁細(xì)胞與慢速貼壁細(xì)胞逐步分離，便可獲得MDSCs。PP1、PP2以成纖維細(xì)胞為主，細(xì)胞數(shù)量多，貼壁迅速，增殖快，5天左右完全融合；PP3、PP4以肌細(xì)胞為主，數(shù)量減少，增殖較快，1周左右完全融合；PP6貼壁的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，多為小圓形或梭形，體積較小，折光性好，增殖緩慢，另有少量懸浮的細(xì)胞。培養(yǎng)72小時后細(xì)胞數(shù)量增多，呈現(xiàn)梭形或紡錘形，有小克隆團(tuán)形成，分散生長在瓶底。1周左右細(xì)胞明顯分裂增殖，數(shù)量增多，密度增加，形成眾多細(xì)胞團(tuán)，呈簇狀生長，細(xì)胞簇之間有明顯的界限，貼壁細(xì)胞展開生長呈梭形、紡錘性或多角形，細(xì)胞質(zhì)少，胞核增大。10天左右細(xì)胞繼續(xù)增殖，呈長梭形，細(xì)胞之間相互融合，細(xì)胞簇體積增大并相連成片，細(xì)胞間隙變小。2MDSCs傳代細(xì)胞的生長曲線 生長曲線呈現(xiàn)S形，經(jīng)過滯留期、對數(shù)生長期和平臺期。培養(yǎng)2天內(nèi)細(xì)胞分裂擴(kuò)增不明顯，生長速度較慢；3天后細(xì)胞擴(kuò)增明顯，生長速度加快，進(jìn)入對數(shù)生長期；6天后細(xì)胞增殖受到抑制，生長變慢，進(jìn)入平臺期。傳第一代細(xì)胞增殖速度快于傳四代和七代細(xì)胞，同時隨傳代次數(shù)增多，細(xì)胞增殖速度逐漸下降。3不同接種密度對MDSCs生長的影響 在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，吸光度數(shù)值與細(xì)胞數(shù)成正比。在1×10~6個/ml密度接種時吸光度值最大，細(xì)胞數(shù)量最多，活性較好，有利于細(xì)胞的生長和傳代培養(yǎng)。4MDSCs的鑒定 MDSCs對Desmin和Sca-1免疫細(xì)胞化學(xué)染色均呈陽性表達(dá)，，光鏡下胞膜胞漿呈現(xiàn)棕黃色，成纖維細(xì)胞呈陰性反應(yīng)。PP1~PP6中Desmin的陽性表達(dá)率逐漸升高，PP6中兩者陽性表達(dá)率均在90%以上。MDSCs傳一代、四代和七代的細(xì)胞中均對Desmin和Sca-1均呈陽性表達(dá)，表達(dá)率均在80%以上。 結(jié)論： 通過改良混合酶消化法和差速貼壁技術(shù)（preplate），可以獲得新生SD大鼠的MDSCs，傳三代內(nèi)的MDSCs分裂增殖顯著，細(xì)胞活性較好，生長速度較快，在合適的接種密度和培養(yǎng)條件中細(xì)胞分裂增殖最好，可獲得較多數(shù)目的細(xì)胞，Desmin和Sca-1可以鑒定MDSCs，傳至第七代的細(xì)胞仍保持較高的活性。
【關(guān)鍵詞】：肌源性干細(xì)胞 差速貼壁 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 原代培養(yǎng) 生長曲線
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11
• 材料與方法11-16
• 結(jié)果16-19
• 附圖19-28
• 附表28-30
• 討論30-35
• 結(jié)論35
• 參考文獻(xiàn)35-38
• 綜述 骨骼肌肌源干細(xì)胞的特性及應(yīng)用的研究進(jìn)展38-50
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 致謝50-51
• 個人簡歷51

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 施向挺;劉穎;華詠;陳衛(wèi)華;王躍閩;;大鼠腓腸肌肌源細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定[J];同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2009年02期

2 葉錦;靳風(fēng)爍;陳錦;王鵬;梁培禾;聶志林;李黔生;;大鼠肌源性干細(xì)胞的分離、純化和培養(yǎng)[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年14期

3 丁維進(jìn);唐乙;宋艷玲;蘇志達(dá);李翠;劉安堂;胡霞;江華;;應(yīng)用改良差速貼壁法和有限稀釋技術(shù)分離培養(yǎng)小鼠來源肌源干細(xì)胞[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年36期

本文編號：674812