本文關(guān)鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應在脂肪基質(zhì)細胞體外誘導分化為神經(jīng)元過程中的作用

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【摘要】：目的研究在脂肪基質(zhì)細胞（adipose-derived stromal cells, ADSCs）誘導分化為神經(jīng)元過程中誘導后細胞內(nèi)是否存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress, ERS）及其作用，探討在ADSCs誘導分化為神經(jīng)元細胞過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與caspase依賴型細胞凋亡的關(guān)系，從而為提高誘導反應效率和增加誘導后細胞的數(shù)量，以及延長其存活時間奠定基礎(chǔ)，并為進一步的臨床藥物篩選和細胞移植提供理論依據(jù)。 方法1）體外分離、培養(yǎng)ADSCs，倒置相差顯微鏡下觀察ADSCs生長過程中的形態(tài)學變化并計算第2代ADSCs的細胞分化率。2）應用還原劑β-巰基乙醇對傳至第3~6代ADSCs進行誘導，按照誘導時間的不同分為未誘導組、預誘導組、誘導后1h、3h、5h、8h組，應用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài)學變化。3）免疫細胞化學法檢測未誘導ADSCs及誘導后細胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(glucose-regulated protein94，GRP94)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(transcription factor C/EBP homologous protein，CHOP)和細胞凋亡蛋白Caspase-3的表達。4）Western-blotting檢測誘導未誘導ADSCs及誘導后細胞NSE、GRP94、CHOP、Caspase-3的表達。5）透射電子顯微鏡觀察ADSCs誘導分化為神經(jīng)元過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的超微結(jié)構(gòu)變化特征。6）MTT比色法檢測未誘導ADSCs及ADSCs誘導分化為神經(jīng)元過程中各組存活細胞OD值。 結(jié)果1）ADSCs懸液于48小時后完全貼壁，細胞貼壁后形態(tài)多樣，呈長梭形、短梭形、類圓形或不規(guī)則形。原代培養(yǎng)第3天細胞開始增殖，形態(tài)逐漸趨于一致。第10~14天細胞已達到70%~80%融合，此時細胞進行傳代。2）ADSCs傳代第2代培養(yǎng)第7天時的細胞分化率為3.00±0.70%。預誘導組的細胞分化率為4.80±0.84%，細胞伸出短小突起,部分細胞漂浮死亡。在正式誘導反應1h，細胞分化率為63.40±1.14%，細胞核變大變圓，細胞質(zhì)回縮，細胞體周圍伸出類似神經(jīng)元軸突樣的長突起。誘導3h時的細胞分化率為72.60±0.89%，細胞質(zhì)折光性增強，，細胞外可見明顯光暈，細胞的突起進一步伸長。誘導5h時的細胞分化率達到88.20±0.83%，細胞折光性進一步增強，有些細胞突起的末端出現(xiàn)分支，類似于樹突，同時細胞彼此連接交織成網(wǎng)狀，細胞形態(tài)呈典型神經(jīng)元形態(tài)。誘導8h時細胞分化率為86.4±1.82%，與5h時無統(tǒng)計學差異（P0.05），細胞形態(tài)與5h也無明顯變化。3）NSE在未誘導組就可見陽性表達細胞，在細胞漿和突起部位均呈陽性表達，誘導5h的細胞陽性表達率明顯高于1h、3h（P0.05），但與誘導8h的細胞陽性表達率無統(tǒng)計學差異（P0.05）。GRP94在未誘導組、預誘導組、誘導1h、3h、5h、8h均可見陽性細胞表達，陽性表達部位在細胞漿和突起，細胞陽性表達率逐漸降低（P0.05），但5h與8h之間沒有統(tǒng)計學差異（P0.05）。CHOP在未誘導組、預誘導組、誘導1h、3h、5h、8h組均可見陽性細胞表達，細胞陽性表達率逐漸增加（P0.05），陽性表達部位位于細胞核、細胞核周圍和突起的細胞漿，并且在細胞核的陽性表達程度明顯高于在細胞核周圍和細胞突起部位。Caspase-3在未誘導組、預誘導組、誘導1h、3h、5h、8h均可見陽性表達細胞，而且細胞陽性表達率明顯逐漸增加（P0.05），陽性表達部位主要位于細胞體和突起的細胞質(zhì)部位，細胞體的陽性表達程度明顯高于細胞突起部位。4）NSE在未誘導組、預誘導組、誘導1h、3h、5h、8h的表達水平明顯逐漸增加（P0.05），但誘導5h與8h組沒有統(tǒng)計學差異（P0.05）。GRP94的表達水平在未誘導組、預誘導組、誘導1h、3h、5h、8h組明顯逐漸降低（P0.05），但未誘導組與預誘導組無明顯統(tǒng)計學差異（P0.05）。CHOP在未誘導組、預誘導組，誘導1h、3h、5h、8h組的表達水平明顯逐漸增加（P0.05），至8h達到高峰，各組之間比較均有統(tǒng)計學差異。Caspase-3在未誘導組、預誘導組，誘導1h、3h、5h、8h組的表達水平明顯逐漸增加（P0.05），至8h達到高峰，但5h與8h組無統(tǒng)計學差異（P0.05）。5）在透射電子顯微鏡下可以見到ADSCs誘導分化為神經(jīng)元過程中5h組的神經(jīng)元細胞質(zhì)內(nèi)有正常平行排列及非平行排列的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和尼氏小體。在部分神經(jīng)元細胞的細胞質(zhì)內(nèi)還可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕至中度擴張，甚至可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重度腫脹擴張，空泡狀改變以及脫顆�，F(xiàn)象，細胞核形狀不規(guī)則，染色質(zhì)濃縮呈塊狀并高度凝聚、邊緣化而核膜完整。6）存活細胞的吸光度值在未誘導組，預誘導組，誘導1h，3h，5h，8h組逐漸減低，至8h達到最低（P0.05）。 結(jié)論在ADSCs誘導分化為神經(jīng)元過程中，UPR明顯受到抑制，而細胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號傳導通路的活性明顯增強，導致細胞凋亡所致細胞死亡數(shù)量顯明增加，細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑的凋亡反應是引發(fā)誘導反應過程中細胞死亡重要原因之一。
【關(guān)鍵詞】：脂肪基質(zhì)細胞 誘導分化 神經(jīng)元 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 GRP94 CHOP Caspase-3 凋亡
【學位授予單位】：河北聯(lián)合大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.28
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文縮略表10-11
• 引言11-13
• 第1章 實驗研究13-44
• 1.1 材料與方法13-25
• 1.1.1 材料13-17
• 1.1.2 實驗方法17-25
• 1.2 結(jié)果25-37
• 1.2.1 ADSCs 原代及傳代細胞的形態(tài)學特征25
• 1.2.2 ADSCs 體外誘導分化為神經(jīng)元過程中的細胞形態(tài)學特征及各組 細胞的分化率25-32
• 1.2.3 ADSCs 誘導分化為神經(jīng)元過程中 NSE/GPR94/CHOP/Caspase-3 的免疫細胞化學檢測結(jié)果32-33
• 1.2.4 ADSCs 誘導分化為神經(jīng)元過程中 NSE/GRP94/CHOP/Caspase-3 的 Western blotting 檢測結(jié)果33-36
• 1.2.5 ADSCs 誘導分化為神經(jīng)元過程中細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的超微結(jié)構(gòu)特征36
• 1.2.6 誘導反應過程中細胞生長狀態(tài)的 MTT 法檢測結(jié)果36-37
• 1.3 討論37-40
• 1.4 結(jié)論40
• 參考文獻40-44
• 第2章 綜述 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與細胞凋亡44-52
• 2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激44-47
• 2.1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的概念和功能44-45
• 2.1.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的起始-未折疊蛋白反應的觸發(fā)45
• 2.1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的啟動者-分子伴侶 GRP78/Bip45-46
• 2.1.4 PERK 介導的生存信號途徑46
• 2.1.5 IRE1 信號生存通路46-47
• 2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑誘發(fā)的細胞凋亡47-48
• 2.2.1 CHOP/GADDl53 轉(zhuǎn)錄激活47-48
• 2.2.2 c-jun 氨基末端激酶途徑誘導的細胞凋亡48
• 2.2.3 Caspase-12 的激活48
• 2.3 結(jié)語48-49
• 參考文獻49-52
• 致謝52-53
• 導師簡介53-54
• 作者簡介54-55
• 學位論文數(shù)據(jù)集55

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 ;Ultrastructure of neuronal-like cells differentiated from adult adipose-derived stromal cells[J];Neural Regeneration Research;2010年19期

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4 周向陽;鄧永文;方芳;王飛;陳若琨;宋濤;方加勝;;自體脂肪干細胞移植腦凍傷大鼠腦內(nèi)的作用[J];中國組織工程研究與臨床康復;2008年16期

5 歐亞;元小冬;蔡亞楠;陸艷卉;;ADSC源性神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞不同方向分化時的超微結(jié)構(gòu)變化研究[J];中國病理生理雜志;2011年07期

6 趙黔魯,柴錫慶;魚藤酮誘發(fā)PC12細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的鈣機制和超微結(jié)構(gòu)的變化[J];中華神經(jīng)科雜志;2005年06期

本文編號：664632