本文關(guān)鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)在脂肪基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過程中的作用

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【摘要】：目的研究在脂肪基質(zhì)細(xì)胞（adipose-derived stromal cells, ADSCs）誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過程中誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)是否存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress, ERS）及其作用，探討在ADSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與caspase依賴型細(xì)胞凋亡的關(guān)系，從而為提高誘導(dǎo)反應(yīng)效率和增加誘導(dǎo)后細(xì)胞的數(shù)量，以及延長(zhǎng)其存活時(shí)間奠定基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步的臨床藥物篩選和細(xì)胞移植提供理論依據(jù)。 方法1）體外分離、培養(yǎng)ADSCs，倒置相差顯微鏡下觀察ADSCs生長(zhǎng)過程中的形態(tài)學(xué)變化并計(jì)算第2代ADSCs的細(xì)胞分化率。2）應(yīng)用還原劑β-巰基乙醇對(duì)傳至第3~6代ADSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，按照誘導(dǎo)時(shí)間的不同分為未誘導(dǎo)組、預(yù)誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)后1h、3h、5h、8h組，應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。3）免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)未誘導(dǎo)ADSCs及誘導(dǎo)后細(xì)胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(glucose-regulated protein94，GRP94)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(transcription factor C/EBP homologous protein，CHOP)和細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)。4）Western-blotting檢測(cè)誘導(dǎo)未誘導(dǎo)ADSCs及誘導(dǎo)后細(xì)胞NSE、GRP94、CHOP、Caspase-3的表達(dá)。5）透射電子顯微鏡觀察ADSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的超微結(jié)構(gòu)變化特征。6）MTT比色法檢測(cè)未誘導(dǎo)ADSCs及ADSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過程中各組存活細(xì)胞OD值。 結(jié)果1）ADSCs懸液于48小時(shí)后完全貼壁，細(xì)胞貼壁后形態(tài)多樣，呈長(zhǎng)梭形、短梭形、類圓形或不規(guī)則形。原代培養(yǎng)第3天細(xì)胞開始增殖，形態(tài)逐漸趨于一致。第10~14天細(xì)胞已達(dá)到70%~80%融合，此時(shí)細(xì)胞進(jìn)行傳代。2）ADSCs傳代第2代培養(yǎng)第7天時(shí)的細(xì)胞分化率為3.00±0.70%。預(yù)誘導(dǎo)組的細(xì)胞分化率為4.80±0.84%，細(xì)胞伸出短小突起,部分細(xì)胞漂浮死亡。在正式誘導(dǎo)反應(yīng)1h，細(xì)胞分化率為63.40±1.14%，細(xì)胞核變大變圓，細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞體周圍伸出類似神經(jīng)元軸突樣的長(zhǎng)突起。誘導(dǎo)3h時(shí)的細(xì)胞分化率為72.60±0.89%，細(xì)胞質(zhì)折光性增強(qiáng)，，細(xì)胞外可見明顯光暈，細(xì)胞的突起進(jìn)一步伸長(zhǎng)。誘導(dǎo)5h時(shí)的細(xì)胞分化率達(dá)到88.20±0.83%，細(xì)胞折光性進(jìn)一步增強(qiáng)，有些細(xì)胞突起的末端出現(xiàn)分支，類似于樹突，同時(shí)細(xì)胞彼此連接交織成網(wǎng)狀，細(xì)胞形態(tài)呈典型神經(jīng)元形態(tài)。誘導(dǎo)8h時(shí)細(xì)胞分化率為86.4±1.82%，與5h時(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05），細(xì)胞形態(tài)與5h也無明顯變化。3）NSE在未誘導(dǎo)組就可見陽性表達(dá)細(xì)胞，在細(xì)胞漿和突起部位均呈陽性表達(dá)，誘導(dǎo)5h的細(xì)胞陽性表達(dá)率明顯高于1h、3h（P0.05），但與誘導(dǎo)8h的細(xì)胞陽性表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。GRP94在未誘導(dǎo)組、預(yù)誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)1h、3h、5h、8h均可見陽性細(xì)胞表達(dá)，陽性表達(dá)部位在細(xì)胞漿和突起，細(xì)胞陽性表達(dá)率逐漸降低（P0.05），但5h與8h之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。CHOP在未誘導(dǎo)組、預(yù)誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)1h、3h、5h、8h組均可見陽性細(xì)胞表達(dá)，細(xì)胞陽性表達(dá)率逐漸增加（P0.05），陽性表達(dá)部位位于細(xì)胞核、細(xì)胞核周圍和突起的細(xì)胞漿，并且在細(xì)胞核的陽性表達(dá)程度明顯高于在細(xì)胞核周圍和細(xì)胞突起部位。Caspase-3在未誘導(dǎo)組、預(yù)誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)1h、3h、5h、8h均可見陽性表達(dá)細(xì)胞，而且細(xì)胞陽性表達(dá)率明顯逐漸增加（P0.05），陽性表達(dá)部位主要位于細(xì)胞體和突起的細(xì)胞質(zhì)部位，細(xì)胞體的陽性表達(dá)程度明顯高于細(xì)胞突起部位。4）NSE在未誘導(dǎo)組、預(yù)誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)1h、3h、5h、8h的表達(dá)水平明顯逐漸增加（P0.05），但誘導(dǎo)5h與8h組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。GRP94的表達(dá)水平在未誘導(dǎo)組、預(yù)誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)1h、3h、5h、8h組明顯逐漸降低（P0.05），但未誘導(dǎo)組與預(yù)誘導(dǎo)組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。CHOP在未誘導(dǎo)組、預(yù)誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)1h、3h、5h、8h組的表達(dá)水平明顯逐漸增加（P0.05），至8h達(dá)到高峰，各組之間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Caspase-3在未誘導(dǎo)組、預(yù)誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)1h、3h、5h、8h組的表達(dá)水平明顯逐漸增加（P0.05），至8h達(dá)到高峰，但5h與8h組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。5）在透射電子顯微鏡下可以見到ADSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過程中5h組的神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有正常平行排列及非平行排列的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和尼氏小體。在部分神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)還可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕至中度擴(kuò)張，甚至可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重度腫脹擴(kuò)張，空泡狀改變以及脫顆�，F(xiàn)象，細(xì)胞核形狀不規(guī)則，染色質(zhì)濃縮呈塊狀并高度凝聚、邊緣化而核膜完整。6）存活細(xì)胞的吸光度值在未誘導(dǎo)組，預(yù)誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)1h，3h，5h，8h組逐漸減低，至8h達(dá)到最低（P0.05）。 結(jié)論在ADSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過程中，UPR明顯受到抑制，而細(xì)胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性明顯增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡所致細(xì)胞死亡數(shù)量顯明增加，細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑的凋亡反應(yīng)是引發(fā)誘導(dǎo)反應(yīng)過程中細(xì)胞死亡重要原因之一。
【關(guān)鍵詞】：脂肪基質(zhì)細(xì)胞 誘導(dǎo)分化 神經(jīng)元 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 GRP94 CHOP Caspase-3 凋亡
【學(xué)位授予單位】：河北聯(lián)合大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.28
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文縮略表10-11
• 引言11-13
• 第1章 實(shí)驗(yàn)研究13-44
• 1.1 材料與方法13-25
• 1.1.1 材料13-17
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法17-25
• 1.2 結(jié)果25-37
• 1.2.1 ADSCs 原代及傳代細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征25
• 1.2.2 ADSCs 體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過程中的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及各組 細(xì)胞的分化率25-32
• 1.2.3 ADSCs 誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過程中 NSE/GPR94/CHOP/Caspase-3 的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果32-33
• 1.2.4 ADSCs 誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過程中 NSE/GRP94/CHOP/Caspase-3 的 Western blotting 檢測(cè)結(jié)果33-36
• 1.2.5 ADSCs 誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過程中細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的超微結(jié)構(gòu)特征36
• 1.2.6 誘導(dǎo)反應(yīng)過程中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的 MTT 法檢測(cè)結(jié)果36-37
• 1.3 討論37-40
• 1.4 結(jié)論40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 第2章 綜述 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡44-52
• 2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激44-47
• 2.1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的概念和功能44-45
• 2.1.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的起始-未折疊蛋白反應(yīng)的觸發(fā)45
• 2.1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的啟動(dòng)者-分子伴侶 GRP78/Bip45-46
• 2.1.4 PERK 介導(dǎo)的生存信號(hào)途徑46
• 2.1.5 IRE1 信號(hào)生存通路46-47
• 2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘發(fā)的細(xì)胞凋亡47-48
• 2.2.1 CHOP/GADDl53 轉(zhuǎn)錄激活47-48
• 2.2.2 c-jun 氨基末端激酶途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡48
• 2.2.3 Caspase-12 的激活48
• 2.3 結(jié)語48-49
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 致謝52-53
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介53-54
• 作者簡(jiǎn)介54-55
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集55

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

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本文編號(hào)：664632