本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌RD1蛋白PE35經(jīng)TLR2干擾IL-1β信號傳遞

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【摘要】：結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的致病菌,是歷史上最成功的致病菌之一,全球約1/3的人口感染過結(jié)核菌,每年約150萬人死于結(jié)核菌感染。耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)和與HIV的共感染更加劇了結(jié)核病控制形勢。 PE家族作為結(jié)核菌基因組中一個獨特的家族。PE家族基因有兩個亞家族：PE和PE_PGRS.目前為止,有許多PE_PGRS亞家族的功能的研究,包括改變細胞結(jié)構(gòu)和菌落形態(tài),作為酯酶為遲留的分枝桿菌提供能量,與抗原變異有關(guān),維持結(jié)核分枝桿菌在肉芽腫中的遲留狀態(tài)。然而,PE家族的蛋白在結(jié)核分枝桿菌致病性中的功能仍然是未知的。PE35,一個PE家族成員,同時屬于RD1,在致病的分枝桿菌種是較保守的,在減毒株BCG中是不存在的,推測其可能與結(jié)核分枝桿菌的毒力相關(guān)。 位于天然免疫細胞上的不同的模式識別受體(PPRs)識別分枝桿菌組分,引起細胞因子的誘導,從而有利于感染的早期控制。許多細胞因子與結(jié)核分枝桿菌的控制有關(guān),如IL-12p70, IL-23, IL-27, IL-35, IL-1α, IL-1β,IL-18, IL-33,TNF-a, IFN-y, Type IIFNs,IL-17,Th17-相關(guān)細胞因子,IL-10和其他的免疫抑制細胞因子。我們研究PE35在巨噬細胞中促炎細胞因子產(chǎn)生中的作用及其涉及的信號通路。以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組為模板,擴增PE35基因,把PCR膠回收產(chǎn)物與pMD19-T載體相連,再亞克隆進pEGFP-C1質(zhì)粒上。重組的pEGFP-C1-PE35質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染進RAW264.7細胞中。用LPS預處理RAW264.7細胞,通過實時定量熒光PCR和ELISA檢測了細胞因子的表達。此外,我們也通過免疫印跡實驗鑒別了引起細胞因子減弱表達的信號通路。最后,我們也進行了驗證PE35與TLR2相互作用的pull down實驗。 PE35在巨噬細胞中減弱了LPS誘導的促炎的細胞因子IL-1β的產(chǎn)生,這種效應不依賴于p38MAPK和Erk1/2途徑。而且, pull down實驗發(fā)現(xiàn)了PE35與TLR2的相互作用。IL-1β在細胞適應性反應中誘導Th17極化�？傊�,這些結(jié)果表明,PE35可能作為一個新的TLR2配體,通過降低IL-1p的產(chǎn)生減弱Th17適應性反應,從而有利于結(jié)核分枝桿菌的入侵。
【關(guān)鍵詞】：PE35 TLR2 IL-1β 結(jié)核分枝桿菌 轉(zhuǎn)染
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：Q78;R378.911
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 第1章 綜述12-18
• 1.1 結(jié)核病與人類健康12
• 1.2 分枝桿菌與TLR2的相互作用12-13
• 1.3 IL-1β的產(chǎn)生,加工分泌,及其在MTB感染控制中的作用13-15
• 1.3.1 IL-1β在宿主的天然免疫中的作用及與之相關(guān)的疾病13
• 1.3.2 激活I(lǐng)L-1β表達的病原體相關(guān)分子模式13-14
• 1.3.3 IL-1β的加工和分泌14-15
• 1.3.4 IL-1β的作用15
• 1.4 MAPK調(diào)控IL-1β的表達15-17
• 1.4.1 MAPK簡介15-16
• 1.4.2 p38 MAPK16
• 1.4.3 ERK1/216
• 1.4.4 PI3K-Akt途徑16-17
• 1.5 PE家族和PE3517-18
• 第2章 前言18-19
• 第3章 實驗材料和方法19-34
• 3.1 實驗材料19-24
• 3.1.1 實驗菌株、質(zhì)粒和細胞19
• 3.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑19-24
• 3.1.3 主要儀器24
• 3.2 實驗方法24-34
• 3.2.1 結(jié)核分枝桿菌PE35基因(Rv3872)PCR引物的設計與合成24
• 3.2.2 結(jié)核分枝桿菌PE35基因(Rv3872)擴增24-25
• 3.2.3 PCR擴增產(chǎn)物的柱式膠回收純化25
• 3.2.4 Rv3872基因的TA克隆25-26
• 3.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化26
• 3.2.6 質(zhì)粒的提取26
• 3.2.7 Rv3872基因亞克隆至pET-28,pEGFP-C1質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株中26-27
• 3.2.8 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染27-28
• 3.2.9 轉(zhuǎn)染細胞的篩選28
• 3.2.10 GFP,GFP-PE35融合蛋白在轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞中的鑒定28-29
• 3.2.11 LPS處理29
• 3.2.12 細胞上清的收集29
• 3.2.13 RAW264.7細胞培養(yǎng)29
• 3.2.14 ELISA實驗29-30
• 3.2.15 western blot分析30-31
• 3.2.16 cDNA合成31-32
• 3.2.17 實時定量熒光實時定量熒光PCR32
• 3.2.18 Pull down分析試劑32
• 3.2.19 純化天然His標簽蛋白32-33
• 3.2.20 數(shù)據(jù)處理33-34
• 第4章 結(jié)果與分析34-43
• 4.1 pEGFP-C1-PE35重組質(zhì)粒的構(gòu)建34-35
• 4.1.1 Rv3872基因的PCR擴增和鑒定34
• 4.1.2 重組質(zhì)粒T-PE35的鑒定34
• 4.1.3 在大腸桿菌DH5α菌株中構(gòu)建并鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-C1-PE3534-35
• 4.2 轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞中的pEGFP-C1和重組質(zhì)粒pEGFP-C1-PE #35的鑒定35-37
• 4.2.1 瞬時轉(zhuǎn)染細胞的獲得35
• 4.2.2 獲得穩(wěn)定表達PE35蛋白的RAW264.7細胞系35-36
• 4.2.3 PE35基因整合進RAW264.7細胞的基因組中36
• 4.2.4 PE35基因在RAW264.7細胞中成功轉(zhuǎn)錄36-37
• 4.2.5 PE35蛋白在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞中表達37
• 4.3 PE35降低LPS誘導的IL-1β產(chǎn)生37-38
• 4.4 PE35減弱IL-1β表達的能力不依賴于p38 MAPK和ERK1/2途徑38-39
• 4.5 pET-28-Rv3872融合蛋白的表達,純化和鑒定39-41
• 4.5.1 Rv3872基因的PCR擴增和鑒定39-40
• 4.5.2 在大腸桿菌DH5α菌株中構(gòu)建并鑒定重組質(zhì)粒pET-28-Rv3872重組質(zhì)粒40
• 4.5.3 在大腸桿菌BL21菌株中構(gòu)建并鑒定重組質(zhì)粒pET-28-Rv387240-41
• 4.5.4 pET-28-Rv3872重組蛋白表達和純化41
• 4.6 在RAW264.7中,PE35蛋白能與TLR2結(jié)合41-43
• 第5章 結(jié)論與展望43-46
• 5.1 實驗結(jié)論與分析43-44
• 5.2 展望44-46
• 參考文獻46-50
• 致謝50-52
• 在學期間所發(fā)表的文章52

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 時欣欣;鮑朗;邱云青;郭思;;結(jié)核分枝桿菌毒力分泌基因Rv3872重組卡介苗的構(gòu)建及表達[J];細胞與分子免疫學雜志;2010年06期

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本文編號：657753