本文關(guān)鍵詞：重組質(zhì)粒pFLAG-CMV2-FcDDR2的構(gòu)建及應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 重組質(zhì)粒 FcDDR HEKT細(xì)胞 膠原刺激 磷酸化

【摘要】：目的構(gòu)建人盤狀結(jié)構(gòu)域受體2(DDR2)與IgG Fc段嵌合受體的重組質(zhì)粒(pFLAG-CMV2-Fc DDR2),檢測(cè)其自主磷酸化水平。方法設(shè)計(jì)Fc DDR2克隆引物,以質(zhì)粒pSec Tag2B-Fc DDR2為模板,PCR擴(kuò)增IgG Fc段與DDR2跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的c DNA序列(Fc DDR2),將其插入pFLAG-CMV2真核表達(dá)載體中。PCR擴(kuò)增鑒定并測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒pFLAG-CMV2-Fc DDR2后,將其轉(zhuǎn)染人胚腎HEK293T細(xì)胞,Western blot法驗(yàn)證HEK293T細(xì)胞中目標(biāo)蛋白Fc DDR2的表達(dá)效率。將pcDNA3.1-DDR2轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,給予2型膠原蛋白刺激后作為陽(yáng)性對(duì)照,用小鼠來(lái)源抗DDR2抗體免疫沉淀`pFLAG-CMV2-Fc DDR2陽(yáng)性的HEK293T細(xì)胞及膠原刺激的pcDNA3.1-DDR2陽(yáng)性的HEK293T細(xì)胞,4G10抗體分析DDR2的磷酸化水平,評(píng)價(jià)Fc DDR2的自主磷酸化能力。結(jié)果重組質(zhì)粒pFLAG-CMV2-Fc DDR2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小約2800 bp左右的片段,與預(yù)期相符,測(cè)序驗(yàn)證正確。Western blot結(jié)果提示pFLAG-CMV2-Fc DDR2轉(zhuǎn)染后的HEK293T細(xì)胞,FLAG-Fc DDR2表達(dá)水平顯著上調(diào)。免疫沉淀結(jié)合Western blot分析提示FcDDR2的磷酸化水平與膠原刺激后的DDR2水平相當(dāng)。結(jié)論成功構(gòu)建了pFLAG-CMV2-FcDDR2真核表達(dá)載體,Fc DDR2的自主磷酸化與膠原蛋白刺激后DDR2的活化水平相當(dāng),可以用作DDR2經(jīng)膠原蛋白刺激后的活化替代形式。
【作者單位】： 第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生物制藥學(xué)教研室;寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系;第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心;
【關(guān)鍵詞】： 重組質(zhì)粒 FcDDR HEKT細(xì)胞 膠原刺激 磷酸化
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(81260460,81302560,81273279,81373201) 寧夏醫(yī)科大學(xué)特殊人才啟動(dòng)項(xiàng)目(XT2012005) 陜西省自然科學(xué)基金(2012K-03-05)
【分類號(hào)】：R392
【正文快照】： 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨破壞為重要特征的自身免疫性疾病[1]。研究表明,RA關(guān)節(jié)軟骨破壞進(jìn)程中存在基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)過(guò)度分泌的現(xiàn)象[2],而關(guān)節(jié)滑膜組織中高表達(dá)的盤狀蛋白結(jié)構(gòu)域受體2(discoindin domain recept

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 陳健康;張偉;劉楠楠;劉利兵;田菲;鐵茹;;盤狀結(jié)構(gòu)域受體2胞外區(qū)在酵母系統(tǒng)中的融合表達(dá)、純化和功能鑒定[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年14期

2 唐浚洲;蘇楠;周思儒;李曉剛;謝楊麗;陳林;;手術(shù)誘導(dǎo)的小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中關(guān)節(jié)軟骨MMP-13表達(dá)上調(diào)[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年09期

3 譚婷;劉蕓;羅海華;李翠;姜勇;;Tat-Vp3融合蛋白在桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)與純化及其促凋亡功能的研究[J];感染、炎癥、修復(fù);2014年01期

4 萬(wàn)小娟;黃凌燕;張國(guó)棟;李建峰;;PD98059抑制Peroxynitrite誘導(dǎo)人腦血管平滑肌細(xì)胞DDR_2的表達(dá)[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年08期

5 趙虎;卜歆;張淑雅;任婷婷;蘇金;;DDR2基因缺失小鼠的繁育及子代基因型的鑒定[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年01期

6 楊軍;婁德全;周振東;張欽明;;基質(zhì)金屬蛋白酶和膠原在創(chuàng)傷關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達(dá)[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2011年20期

7 張耀武;方銳;劉振峰;艾力江·阿斯拉;孟慶才;;維藥買朱尼對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型關(guān)節(jié)軟骨中基質(zhì)金屬蛋白酶1和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1的影響劑1的影響[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2011年52期

8 王康;郭生玉;;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的生物治療新進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2010年14期

9 劉喜德;洪旭濤;王云卿;王芳;蔡龍;;膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜基因表達(dá)譜特征研究[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2012年09期

10 唐敏;何成松;;絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)系的研究[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2014年08期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 馮新;重組鱟素的規(guī)�；苽浼捌潴w內(nèi)外生物學(xué)效應(yīng)與作用機(jī)制[D];吉林大學(xué);2011年

2 洪景芳;DDR1在垂體腺瘤海綿竇侵襲中的作用和機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2008年

3 張燕;DDR2在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的作用研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

4 周蕾;弗氏不完全佐劑加BCG熱休克蛋由65對(duì)大鼠關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo)[D];吉林大學(xué);2012年

5 金英利;針刀對(duì)KOA兔韌帶力學(xué)改變及韌帶膠原相關(guān)因子基因蛋白表達(dá)的影響研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2014年

6 徐金科;膠原受體DDR2在頭頸部鱗癌中的作用研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

7 苗立云;DDR2基因在中國(guó)人肺鱗癌患者中的突變篩查及驅(qū)動(dòng)功能的確認(rèn)[D];南京大學(xué);2014年

8 張斯?jié)h;復(fù)元膠囊通過(guò)DDR2對(duì)軟骨細(xì)胞肥厚分化影響的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 宋莎莎;Peroxynitrite誘導(dǎo)下咽癌細(xì)胞凋亡與PDCD4，DDR1及DDR2基因活性相關(guān)性的研究[D];山東大學(xué);2011年

2 孔德淼;盤狀結(jié)構(gòu)域受體-1在食管鱗癌中的表達(dá)及臨床意義[D];中南大學(xué);2012年

3 張煜;DDR2對(duì)缺氧誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2012年

4 朱明霞;DDR1-MMP9通路在大鼠腦缺血損傷所致的血腦屏障破壞中的作用和機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2014年

5 張力文;苗藥組方熏蒸療法對(duì)家兔早期膝骨關(guān)節(jié)炎模型基因表達(dá)譜影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院;2014年

6 萬(wàn)小娟;Peroxynitrite誘導(dǎo)人腦血管平滑肌細(xì)胞DDR_2表達(dá)機(jī)制的研究[D];山東大學(xué);2013年

7 唐敏;馬錢子堿對(duì)TNF-α誘導(dǎo)人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖影響和MAPK通路中JNK調(diào)控的研究[D];瀘州醫(yī)學(xué)院;2014年

8 錢晨;雷公藤紅素通過(guò)調(diào)控趨化因子CCL4的表達(dá)抑制破骨細(xì)胞分化與遷移的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2014年

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 胡剛;李揚(yáng)秋;周羽z，

本文編號(hào)：657625