本文關(guān)鍵詞：乙型肝炎病毒核心抗原相關(guān)抗原的克隆、表達(dá)及抗體制備

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【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis virus B)即乙肝病毒(HBV)，屬DNA病毒，是一種嗜肝病毒，為有包膜的部分雙鏈環(huán)狀DNA病毒。乙型病毒性肝炎（簡稱乙肝）的傳染方式主要通過輸血、注射和母嬰傳播。乙肝病毒(HBV)感染是世界性的難題，全球范圍內(nèi)慢性感染者多達(dá)4億，發(fā)展中國家是乙型肝炎的重災(zāi)區(qū)。乙型肝炎通常會(huì)造成慢性感染，可進(jìn)展為肝硬化乃至肝細(xì)胞癌，對人類健康有巨大的威脅。共價(jià)閉合環(huán)狀脫氧核糖核酸(covalenfly closed circular DNA)即cccDNA，它是乙型肝炎病毒(HBV)復(fù)制中的重要環(huán)節(jié)，是mRNA和前基因組RNA的合成模板，也是HBV難以治愈的關(guān)鍵因素，其長期存在與乙肝的慢性化以及抗病毒治療后復(fù)發(fā)有著重要關(guān)系。故做好cccDNA的檢測工作對于了解患者病情變化、評估治療效果有著十分重要的意義。但肝組織內(nèi)cccDNA的檢測需要做肝組織活檢，患者往往難以接受，所以尋找一種操作方便，靈敏度高的血清學(xué)標(biāo)志很有必要。隨著對乙肝病毒血清標(biāo)志物研究的深入，乙肝病毒核心抗原相關(guān)抗原(Hepatitis B core—related antigen，HBcrAg)逐漸進(jìn)入人們的視線，人們認(rèn)識到了檢測血清中HBcrAg在HBV感染的監(jiān)測及治療中所具有的重要臨床意義。 HBcrAg由HBcAg、HBeAg與P22cr（22kDa precore protein）三種蛋白質(zhì)組成（圖1），其均由前C/C區(qū)編碼。C基因編碼的149個(gè)氨基酸序列為它們所共享。P22cr包含第28至最少第150個(gè)氨基酸序列，是前核心區(qū)編碼的蛋白，它包括N端一段未剪切的信號肽但缺少C末端富含精氨酸的片段。P22cr常存在于空缺的、不含病毒核心的病毒顆粒。 要對HBcrAg進(jìn)一步研究，建立檢測HBcrAg的檢測方法則是必須的。因此建立雙抗體夾心的ELISA方法檢測HBcrAg成為迫切需要，故獲取HBcrAg的相關(guān)抗體成為目前的首要任務(wù)。本課題擬表達(dá)HBcAg、HBeAg、P22cr蛋白及表達(dá)這三種蛋白所共享的149個(gè)氨基酸所組成的蛋白（我們命名為1149蛋白）。然后以HBcAg中149183這段多肽制備能特異檢測HBcAg的多克隆抗體，以HBeAg中10至1這段多肽制備能特異檢測HBeAg的多克隆抗體，以P22cr蛋白中28至10這段多肽制備能特異檢測P22cr的多克隆抗體。1149蛋白作為免疫原來制備相應(yīng)的多克隆抗體及單克隆抗體。這些抗體的制備將為今后研究HBcrAg奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為乙肝血清學(xué)檢測的研究擴(kuò)展了方向。 本研究應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)成功表達(dá)了HBcAg的重組蛋白、HBeAg的重組蛋白及P22cr重組蛋白，并制備了這三種蛋白中特異片段的多肽。然后在這個(gè)基礎(chǔ)上制備了多克隆抗體且建立了能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，主要結(jié)果如下：①根據(jù)GenBank公布的核苷酸序列，，我們設(shè)計(jì)了HBcAg、HBeAg、P22cr及1149蛋白的PCR引物，運(yùn)用PCR技術(shù)以含HBV全基因片段的質(zhì)粒（HBV BJ）為模板，成功克隆了編碼HBcAg、HBeAg、P22cr及1149蛋白的基因片段，隨后成功構(gòu)建了這四種蛋白的pGEX4T1原核表達(dá)載體，構(gòu)建的原核表達(dá)載體pGEX4T1用Nde I和Xho I進(jìn)行了雙酶切，電泳可見到與理論位置相一致的條帶，說明表達(dá)載體構(gòu)建成功。②經(jīng)過一系列嘗試，得到最優(yōu)誘導(dǎo)條件，在37℃，IPTG0.8mM/L，誘導(dǎo)了3.5小時(shí)，成功地在原核系統(tǒng)中高效表達(dá)，并純化了目的蛋白，經(jīng)Western blot證明了目的蛋白的正確性。③人工合成了實(shí)驗(yàn)所需的3種多肽，并經(jīng)過高效液相色譜法及質(zhì)譜法檢測證實(shí)多肽制備正確。通過ELISA方法，我們發(fā)現(xiàn)HBcAg及P22cr對應(yīng)多肽能夠與患者血清中對應(yīng)抗體結(jié)合，說明患者體內(nèi)存在能夠檢測到這兩種多肽抗原表位的抗體。④每種多肽分別偶聯(lián)匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，制備三種免疫原，每種免疫原分別免疫兩只實(shí)驗(yàn)級日本大耳白兔。經(jīng)過五次免疫后制備出高效價(jià)的抗體，并通過Western blot檢測及ELISA方法證實(shí)制備的多抗可與目的蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。⑤以1149蛋白為抗原免疫4只Balb/C小鼠，用血清篩選后選取抗體效價(jià)較好的小鼠用于細(xì)胞融合，融合后經(jīng)有限稀釋法篩選出4株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株（1B8G12A12、4A3B4E6、2C6C8C5、2D7H2A6）繼而制備純化后的抗體。最后用Western blot及ELISA進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)了我們制備的單克隆抗體能與目的蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合。 本課題成功構(gòu)建了HBcrAg的原核表達(dá)載體，并誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，制備出具有高效價(jià)、高特異性和良好抗原結(jié)合能力的多克隆抗體與單克隆抗體，為進(jìn)一步研究HBcrAg,建立高特異性、高敏感性的檢測方法奠定了良好的基礎(chǔ)，對監(jiān)測乙型肝炎患者病情、預(yù)后及評價(jià)治療效果具有一定意義及應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒 HBcrAg cccDNA 原核表達(dá) 多克隆抗體 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373.21;R392
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 英文縮略詞表9-11
• 前言11-13
• 第一部分 乙型肝炎病毒核心抗原相關(guān)抗原的克隆、表達(dá)13-36
• 一、實(shí)驗(yàn)材料13-18
• 二、實(shí)驗(yàn)方法18-24
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-34
• 四、討論34-36
• 第二部分 乙型肝炎病毒核心抗原相關(guān)抗原多克隆抗體及單克隆抗體的制備36-57
• 一、實(shí)驗(yàn)材料36-39
• 二、實(shí)驗(yàn)方法39-47
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-55
• 四、討論55-57
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 綜述 乙型肝炎病毒核心抗原相關(guān)抗原的研究近況60-67
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 附錄67-68
• 致謝68-69

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：653001