本文關(guān)鍵詞：大腸埃希菌多重耐藥外排泵AcrAB-TolC主動(dòng)外排機(jī)制的研究

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【摘要】：研究目的：大腸埃希菌是當(dāng)今社區(qū)感染及院內(nèi)感染最常見的病原菌之一,是威脅人類健康的重要致病菌。隨著抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用及抗生素的升級(jí)換代,細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥越來越嚴(yán)重。臨床上多重耐藥大腸埃希菌的出現(xiàn)和播散,嚴(yán)重影響了治療效果,增加了治療成本。對(duì)多重耐藥大腸埃希菌的治療是臨床上非常重要的目標(biāo)。細(xì)菌的耐藥機(jī)制包括產(chǎn)生滅活酶、改變藥物作用靶位、改變外膜通透性、主動(dòng)外排作用,產(chǎn)生生物膜等。其中后三種機(jī)制是細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥的最主要機(jī)制。阻止藥物在菌體內(nèi)聚集是細(xì)菌產(chǎn)生抗生素多重耐藥的重要手段之一,由細(xì)菌的主動(dòng)外排系統(tǒng)介導(dǎo)。大腸埃希菌的細(xì)胞外膜上存在多種外排系統(tǒng)可泵出多種結(jié)構(gòu)無關(guān)的化合物,AcrAB-TolC外排泵是其中最主要的占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的多重藥物外排泵,底物廣泛,研究天津地區(qū)大腸埃希菌外排泵AcrAB-TolC在臨床株中的攜帶情況、與耐藥的相關(guān)性,及羰基氰氯苯腙(CCCP)對(duì)大腸埃希菌外排泵AcrAB-TolC的抑制作用,為臨床多重耐藥大腸埃希菌感染的防治探索可能的、新的思路。 研究方法： 1、菌株的收集、鑒定：收集2008年7月至2009年7月期間天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院臨床分離的大腸埃希菌90株,剔除同一病例相同部位重復(fù)菌株,所有菌株采用常規(guī)生化鑒定。大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922作為質(zhì)量控制菌株,金黃色葡萄球菌ATCC25923為acra/acrb基因陰性對(duì)照菌株,這兩種標(biāo)準(zhǔn)菌株均為天津市感染性疾病研究所保存菌株。 2、耐藥模式分組：采用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定90株大腸埃希菌臨床株對(duì)6種抗菌藥物(氨曲南、頭孢噻肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、阿米卡星)的敏感性,藥敏結(jié)果依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI2011)判定標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)耐藥模式分為多重耐藥組、雙藥耐藥組、單藥耐藥組、全敏感組。 3、外排泵基因acra/acrb基因的擴(kuò)增：應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增90株臨床分離的大腸埃希菌acra/acrb基因片段,PCR產(chǎn)物送北京華大科技有限公司進(jìn)行正負(fù)雙向DNA序列分析。 4、CCCP印制實(shí)驗(yàn)：選取10株多重耐藥大腸埃希菌進(jìn)行CCCP抑制實(shí)驗(yàn),采取微量肉湯稀釋法測(cè)定加泵抑制劑CCCP(終濃度為100umol/L)前后多重耐藥菌株對(duì)5種抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)。 結(jié)果： 1、共收集大腸埃希菌90株,其中尿道分離菌37株,腸道分離菌36株,呼吸到分離菌5株,其它分泌物(血液、腹水等)分離菌株11株。 2、體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果：90株大腸埃希菌對(duì)6種抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥,耐藥率由高到低為環(huán)丙沙星67%,左氧氟沙星61%,慶大霉素53%,頭孢噻肟50%,氨曲南20%,阿米卡星10%。耐藥模式以雙藥耐藥30株(33.3%),多重耐藥26株(28.9%)為主,單藥耐藥22株(24.4%),全敏感12株(13.3%)。 3、acra/acrb基因PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果：90株臨床分離的大腸埃希菌中55株(61.1%)均可見567bp (acra)及516bp (acrb)的擴(kuò)增片段。金黃色葡萄球菌ATCC25923未見此擴(kuò)增片段。選取大腸埃希菌臨床株246acra基因擴(kuò)增產(chǎn)物及臨床株b716acrb基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行正負(fù)雙向DNA序列分析,測(cè)序結(jié)果在GeneBank數(shù)據(jù)庫中經(jīng)行同源性對(duì)比后證實(shí)：臨床株246, acra基因同源性為98%,臨床株b716,acrb基因同源性為99%。其中多重耐藥組22株acra陽性(84.6%),acrb21株陽性(80.8%)；雙藥耐藥組acra16株陽性(53.3%),acrb17株陽性(56.7%)；單藥耐藥組acra12株陽性(54.5%),acrb13株陽性(59.1%)；全敏感組acra5株陽性(41.7%),acrb4株陽性(33.3%)�？梢娡馀疟没騛cra/acrb基因在4種耐藥模式的大腸埃希菌臨床株中普遍存在,在多重耐藥組中陽性率最高,分別為84.6%和80.8%。對(duì)多重耐藥組及全敏感組的acra基因及acrb基因陽性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用x2檢驗(yàn),acra基因P=0.017；acrb基因P=0.009,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4、CCCP抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果：10株多重耐藥的大腸埃希菌臨床株在應(yīng)用CCCP后,多數(shù)菌株對(duì)5種抗生素MIC均有不同程度的下降,能使絕大多數(shù)菌株恢復(fù)對(duì)抗生素的敏感性。菌株1034對(duì)頭孢曲松的MIC最高下降倍數(shù)為128倍,菌株A620、C636、1034對(duì)5種抗生素均為耐藥變?yōu)槊舾小６闎1581和菌株O對(duì)5種抗生素的MIC基本沒有改變。 結(jié)論： 1、90株大腸埃希菌臨床株對(duì)6種抗生素均表現(xiàn)出不同程度的耐藥,對(duì)氟喹諾酮類抗生素耐藥率較高,而對(duì)阿米卡星耐藥率較低；耐藥模式以雙藥耐藥和多重耐藥為主。 2、外排泵基因acra/acrb基因在4種耐藥模式的大腸埃希菌臨床株中普遍存在,其中,在多重耐藥組中陽性率最高分別為84.6%和80.8%,在全敏感組陽性率最低分別為41.7%和33.3%。二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3、多數(shù)細(xì)菌具有主動(dòng)外排作用,CCCP能有效抑制細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的主動(dòng)外排作用,MIC下降倍數(shù)不等,說明外排泵主動(dòng)外排作用大小不等,或主動(dòng)外排機(jī)制可能與其它機(jī)制一起導(dǎo)致大腸桿菌抗菌藥物多重耐藥。
【關(guān)鍵詞】：大腸埃希菌 多重耐藥 外排泵 耐藥-結(jié)分-裂家族 羰基-氰-間-氯苯腙
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378.21
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• ~.略語/符號(hào)說明12-14
• 前言14-22
• 研究現(xiàn)狀、成果14-21
• 研究目的、方法21-22
• 一、大腸埃希菌臨床株的耐藥譜分析及藥敏表型分組22-29
• 1.1 對(duì)象和方法22-25
• 1.1.1 材料22-23
• 1.1.2 方法23-25
• 1.2 結(jié)果25-26
• 1.2.1 大腸埃希菌臨床株的標(biāo)本來源25
• 1.2.2 大腸埃希菌體外藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果25
• 1.2.3 大腸埃希菌臨床株耐藥模式分組25-26
• 1.3 討論26-28
• 1.4 小結(jié)28-29
• 二、大腸埃希菌臨床株多重耐藥外排泵基因acra、acrb的檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析29-38
• 2.1 對(duì)象和方法29-33
• 2.1.1 材料29-30
• 2.1.2 方法30-33
• 2.2 結(jié)果33-34
• 2.2.1 外排泵基因PCR結(jié)果33-34
• 2.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析34
• 2.2.3 基因測(cè)序結(jié)果34
• 2.3 討論34-36
• 2.4 小結(jié)36-38
• 三、質(zhì)子泵抑制劑CCCP對(duì)多重耐藥大腸埃希菌MIC的影響38-45
• 3.1 材料與方法38-40
• 3.1.1 材料38-39
• 3.1.2 方法39-40
• 3.2 結(jié)果40-43
• 3.3 討論43-44
• 3.4 小結(jié)44-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明50-51
• 綜述51-64
• 綜述參考文獻(xiàn)57-64
• 致謝64

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：645971