本文關(guān)鍵詞：流式細胞術(shù)測定蠕形螨基因組大小

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【摘要】：目的蠕形螨感染可能與人類痤瘡、毛囊炎、脂溢性皮炎、酒渣鼻、眼瞼緣炎和外耳道瘙癢等病癥有關(guān),蠕形螨病致病機理的研究成為寄生蟲學(xué)和皮膚病學(xué)領(lǐng)域倍受關(guān)注的課題。人群對蠕形螨普遍易感,國內(nèi)報道人群感染率20%到90%不等,成年人患病率高達10%。目前有關(guān)蠕形螨的報道多見于形態(tài)學(xué)、流行病學(xué)、治療藥物等方面的研究。兩種人體蠕形螨蟲體微小,僅100μm-400μm,分別寄生于于毛囊、皮脂腺內(nèi)。因取螨和清洗、分離、研磨粉碎等顯微預(yù)處理技術(shù)瓶頸,限制了蠕形螨的分子生物學(xué)研究,目前這方面的研究成果鮮有報道�；蚪M是指單倍體細胞核內(nèi)的全部DNA分子,或者是單拷貝染色體DNA的總量,其大小常用C值(C-value)來描述,單位為pg或Mb。測定一個物種的基因組大小對構(gòu)建高質(zhì)量基因文庫有重要意義,也是研究一個物種基因組的重要參數(shù),是篩選蠕形螨的功能基因和將來研究其分子致病機理的重要基礎(chǔ)工作。本實驗著力探索優(yōu)化蠕形螨DNA的提取方法,采用流式細胞術(shù)(Flow cytometry, FCM)測定蠕形螨基因組大小,為進一步構(gòu)建蠕形螨基因文庫及其基因組學(xué)研究提供了理論數(shù)據(jù),為下一步蠕形螨的分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、生物信息學(xué)研究做了基礎(chǔ)鋪墊。 方法以山羊蠕形螨為實驗材料,這是因為：人體蠕形螨實驗樣品需要志愿者提供；獲取足量的實驗螨有一定困難；人體蠕形螨樣品的保存也有困難。山羊蠕形螨與人皮脂蠕形螨遺傳相似度最近,樣品容易獲得,山羊蠕形螨導(dǎo)致羊皮病理損害已被公認,所以本實驗以山羊蠕形螨為實驗樣本。樣品從感染蠕形螨的波爾山羊皮膚結(jié)節(jié)中獲取。自然沉降法清洗收集活螨。以組織勻漿器和超聲波破碎螨體,在檸檬酸介質(zhì)中分離蠕形螨的細胞核。家雞血細胞經(jīng)超聲波細胞破碎儀處理后,同樣采用檸檬酸介質(zhì)分離細胞核。以PBS懸浮細胞核,稀釋后經(jīng)Giemsa染色,應(yīng)用光學(xué)顯微鏡檢查樣品質(zhì)量,包括細胞核密度及細胞碎片的檢查。根據(jù)計數(shù)結(jié)果以PBS將細胞核懸液稀釋至1.0×106個/ml,即適宜流式細胞儀檢測的上機濃度。以動物基因組DNA抽提試劑盒提取蠕形螨核DNA,使用0.7%的瓊脂糖凝膠進行電泳,初步檢測待檢核DNA的純度及大小。以家雞血細胞核DNA含量為內(nèi)標,混合家雞血細胞核和蠕形螨細胞核,碘化丙啶(Propidium iodide, PI)染色后用流式細胞儀上機檢測,記錄610nm發(fā)射波長的PI熒光強度。運用WinMDI軟件分析數(shù)據(jù),比較蠕形螨與家雞血細胞DNA含量峰值的倍數(shù)關(guān)系,計算出蠕形螨的基因組大小。 結(jié)果采用檸檬酸介質(zhì)分離得到完整、分散的細胞核,細胞碎片較少,稀釋后樣品濃度為1.0×106個/ml,滿足流式細胞儀上機檢測要求。用動物基因組DNA抽提試劑盒提取到蠕形螨核DNA,經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測,在20kb處獲得一均勻亮帶。采用FCM測得蠕形螨DNA含量約為1.05pg/2C,以1pg DNA相當于978Mb計算得出蠕形螨基因組大小約為512Mb。 結(jié)論本研究成功分離了蠕形螨細胞核,運用動物基因組DNA抽提試劑盒快速高效提取到蠕形螨核DNA。普通瓊脂糖凝膠電泳可進行基因組DNA完整性和純度的初步分析,但不能將超過20kb大小的DNA分子分開。流式細胞術(shù)可快速、精確測定蠕形螨基因組大小。本研究獲得了蠕形螨的基因組大小數(shù)據(jù),豐富了蠕形螨的遺傳學(xué)資料,為蠕形螨基因組研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：蠕形螨 基因組大小 基因組學(xué) 流式細胞術(shù)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R384.4
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-21
• 材料與方法21-32
• 實驗結(jié)果32-37
• 討論37-42
• 參考文獻42-52
• 致謝52-53
• 研究生期間發(fā)表的論著53-54
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表54

【參考文獻】

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本文編號：645815