本文關鍵詞：革蘭陰性超級細菌碳青霉烯酶基因和可移動耐藥元件結構研究

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【摘要】：研究背景與目的 近年來,隨著碳青霉烯類藥物的大量廣泛使用,碳青霉烯耐藥的革蘭陰性超級細菌檢出率越來越高,成為臨床感染治療面臨的重要難題,其耐藥機制研究已成為全球關注的熱點。細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥機制復雜,其中產能滅活碳青霉烯類抗生素的碳青霉烯酶是最重要的原因。細菌耐藥性迅速產生及擴散的最主要原因是耐藥基因的水平轉移,耐藥基因得以在同種或不同種屬的細菌間廣泛傳播是通過多種機制實現(xiàn)的,如接合性質粒、轉座子、整合子或插入序列共同區(qū)(ISCR)等可水平轉移的基因元件。目前國內外的研究,主要集中在可攜帶多種耐藥基因盒的整合子和可攜帶多種耐藥基因盒且傳播能力更強的插入序列共同區(qū)(ISCR1)上。 本研究主要對臨床分離的G-桿菌超級細菌進行常見碳青霉烯酶基因檢測,對常見可移動耐藥元件Ⅰ類整合子和ISCR1進行檢測,了解他們在超級細菌中的分布及結構特征,探討超級細菌的耐藥機制。對重要菌株如NDM和KPC型的超級細菌進行基因定位分析,并對KPC型超級細菌進行MLST和基因環(huán)境分析,以了解耐藥基因水平轉移方式。另外,本研究特別針對兩個水解譜廣、水解功能強的重要基因NDM和KPC,建立一種快速、敏感、特異的雙重熒光定量PCR方法,能在單一體系同時檢測NMD和KPC。 研究方法 1.菌株選取和藥敏實驗及模板DNA制備收集南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院檢驗科微生物室2011年7月至2012年7月臨床分離的來自不同科室不同標本類型的耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細菌、不動桿菌、銅綠假單胞菌。所有菌株的鑒定和藥敏試驗是利用BD100全自動細菌鑒定儀完成。對收集的菌株用SDS裂解,蛋白酶K消化,酚-氯仿提取,醋酸鈉-乙醇沉淀的方法提取細菌的全基因組DNA。 2.常見碳青霉烯酶基因檢測利用普通PCR方法對所有菌株進行7種常見碳青霉烯酶基因KPC、NDM、VIM、IMP、SPM、GES、OXA-48,對于鮑曼不動桿菌特別加測OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-51-like、OXA-58-like四群OXA類的碳青霉烯酶基因。對陽性PCR產物進行測序驗證并確定其亞型。對NDM或KPC的陽性菌株進一步擴增16S核糖體基因序列并測序,以保證屬種鑒定的準確。 3.耐藥基因播散方式研究為對NDM和KPC基因進行定位,對NDM或KPC陽性的菌株進行質粒接合轉移試驗以探討該耐藥基因的播散方式。特別對產KPC的菌株進行MLST分型和基因環(huán)境研究,以和國內外已報道情況進行比較。 4.常見耐藥元件結構研究利用PCR分別擴增Ⅰ類整合子和ISCR1的保守區(qū),陽性菌株進一步擴增二者的可變區(qū),利用限制性內切酶Hinf I和Rsa I酶切可變區(qū),根據(jù)酶切圖譜進行初步分類,不同的酶切譜型挑選2株進行可變區(qū)測序,分析序列的同源性得出耐藥基因盒組合。對同時攜帶整合子和ISCR1的菌株擴增其串聯(lián)區(qū),以驗證是否為復雜性Ⅰ類整合子并通過測序得到復雜性整合子結構。 5.NDM和KPC基因雙重qPCR法的建立將已知的NDM和KPC基因所有亞型序列分別進行同源性比對,找出保守區(qū)進行引物和TaqMan探針的設計。分別構建NDM和KPC基因的質粒標準品,以該標準品對雙重qPCR體系進行優(yōu)化。質粒定量后經過一系列10倍梯度稀釋,使其濃度為108copies/μl～101copies/μl,采用優(yōu)化好的雙重體系評價該方法的敏感性和線性關系。同時選取105copies/μ濃度的質粒連續(xù)三天重復檢測,每次做三個復孔,通過計算各自CT值的變異系數(shù)進行重復性和穩(wěn)定性的評價。利用不含目的基因的標準株(大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黃色葡萄球菌ATCC25923)對該方法進行特異性評價。對經普通PCR和測序驗證NDM和KPC基因已知的220株臨床分離的腸桿菌科細菌(200株碳青霉烯敏感株和20株非敏感株),利用已建立的雙重qPCR方法進行檢測,比較與普通PCR檢測結果的符合率。 研究結果 1.碳青霉烯酶基因檢測結果16株碳青霉烯耐藥腸桿菌科超級細菌中：10株攜帶NDM-1基因包括4株陰溝腸桿菌、3株肺炎克雷伯菌、1株產酸克雷伯菌、1株產氣腸桿菌和1株霍氏腸桿菌(國際首次發(fā)現(xiàn))；1株產氣腸桿菌攜帶IMP-4基因；1株肺炎克雷伯菌同時攜帶IMP-4基因和KPC-2基因；另外4株菌所有檢測的碳青霉烯酶基因均陰性。811株菌共檢出6種碳青霉烯酶基因,具體為：鮑曼不動桿菌中碳青霉烯敏感組25株攜帶OXA-23-like、139株攜帶OXA-51-like、6株攜帶OXA-58-like;非敏感組129株攜帶OXA-23-like、2株攜帶OXA-24-like、126株攜帶OXA-51-like、15株攜帶OXA-58-like;銅綠假單胞菌碳青霉烯敏感組4株攜帶IMP,非敏感組33株攜帶IMP、10株攜帶VIM。其中鮑曼不動桿菌中48株OXA-23-like和OXA-51-like共存；1株OXA-24-like和OXA-51-like共存；14株OXA-58-like和OXA-51-like共存。兩屬種獲得性碳青霉烯酶在敏感組和非敏感組間攜帶率均有統(tǒng)計學差異,非敏感組均高于敏感組。 2.重要基因水平播散方式研究10株NDM陽性的菌株4株成功地將NDM-1耐藥基因轉移給受體菌,進一步分析質粒發(fā)現(xiàn)霍氏腸桿菌攜帶的復雜性Ⅰ類整合子與NDM-1基因共存于同一個接合性質粒上。肺炎克雷伯菌Car11攜帶的KPC-2基因位于接合性質粒,但IMP-4并不位于此質粒。對產KPC-2的肺炎克雷伯菌進行MLST分析發(fā)現(xiàn)為ST530,這種罕見的ST序列型為國際首次報道。 3.Ⅰ類整合子檢測結果16株菌中共有10株整合酶擴增陽性,進一步擴增整合子可變區(qū)發(fā)現(xiàn)10株均陽性。整合子可變區(qū)陽性PCR產物測序結果顯示這10株菌共攜帶5種不同類型的基因盒,具體為：肺炎克雷伯菌Car1、產酸克雷伯菌Car4和產氣腸桿菌Car12共3株菌攜帶aar-3+dfrA27基因盒：陰溝腸桿菌Car5-8共4株攜帶aadB+aadA1基因盒；霍氏腸桿菌Car9攜帶dfrA16+aadA2基因盒；陰溝腸桿菌Car14攜帶arr3+aadAl基因盒；肺炎克雷伯菌Car16攜帶dfrA17+aadA5基因盒。391株鮑曼不動桿菌中230株菌整合子擴增陽性共攜帶6種不同基因盒排列的Ⅰ類整合子,其中碳青霉烯碳青霉烯非敏感組中135株(78.4%)陽性,敏感組中95(43.4%)株陽性,兩組間攜帶率有統(tǒng)計學差異,非敏感組明顯高于敏感組。420株銅綠假單胞菌60株攜帶共14種不同基因盒排列的Ⅰ類整合子,其中敏感組14株(6.3%),非敏感組46株陽性,兩組間攜帶率無統(tǒng)計學差異。具體為：164株aacA4+catB8+aadA1,48株aacC1+orfP+orfP,12株arr-3+aacA4,1株blaPSE,3株dfrA17+aadA5,2株aacA4。420株銅綠假單胞菌60株攜帶共14種不同基因盒排列的Ⅰ類整合子。具體為：9株aacA4+aadA2,3株aadAl,aadA2、 cmlA1+aadA2、tetR、oxa-10各1株,aadA4、aacA4各5株,aadB+cmlA6、 aadA7、dfrA17+aadA5各4株,13株aadB+blaPSE-1,2株IMP-9+aadA2,7株aacA4+catB8+aadAl。 4.ISCR1檢測結果16株腸桿菌科超級細菌ISCR1保守區(qū)擴增8株有目的條帶擴增,進一步擴增ISCR1可變區(qū)發(fā)現(xiàn)這8(50%)株菌均陽性,陽性的可變區(qū)PCR產物測序結果顯示共存在3種不同的可變區(qū)類型,具體結果如下：肺炎克雷伯菌Carl、16和產氣腸桿菌Car12-13及霍氏腸桿菌Car9共5株ISCR1結構排列為ISCR1+qnrA1+ampR+qacEA1;產酸克雷伯菌Car4ISCR1結構排列為ISCR1+short chain dehydrogenase/reductase+qnrB6+qacE△1;產氣腸桿菌Car10和肺炎克雷伯菌Car15共2株ISCR1結構排列為ISCR1+sapA+qnrB2+qacE△1。811株非發(fā)酵菌中共185株ISCR1可變區(qū)陽性,鮑曼不動桿菌共162株陽性,其中碳青霉烯敏感組72(32.9%)株陽性,非敏感組90(52.3%)株陽性,二組間攜帶率有統(tǒng)計學差異,非敏感組明顯高于敏感組；銅綠假單胞菌共23株陽性,其中碳青霉烯敏感組9(4.1%)株陽性,非敏感組14(7.1%)株陽性,二組間攜帶率無統(tǒng)計學差異。所有的ISCR1為同一個類型,測序結果顯示ISCR1與blaPER-1、GST-like、ABC transporter基因相連。 5.復雜性整合子結構腸桿菌科超級細菌中4株Ⅰ類整合子和ISCR1共存的菌株經驗證發(fā)現(xiàn)兩株攜帶復雜性Ⅰ類整合子,具體為霍氏腸桿菌Car9攜帶intI1+dfrA16+aadA2+qacdelsul+ISCRl+qnrAl+ampR+qacdelsul;產氣腸桿菌Car12攜帶intI1+aar-3+dfrA27+qacdelsul+ISCRl+qnrA1+ampR+qacdelsul。鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌均存在一種同樣排列組合形式的復雜性整合子intI1+aac A4+catB8+aadA1+qacdelsul+ISCR1+blaPER-1+GST-like+ABC transporter+qacdelsul,具體為：鮑曼不動桿菌碳青霉烯敏感組53(24.2%)株陽性,非敏感組73(42.4%)株陽性,兩組間攜帶率有統(tǒng)計學差異,非敏感組高于敏感組,而銅綠假單胞菌碳青霉烯敏感組1(0.5%)株陽性,非敏感組3(1.5%)株陽性,兩組間攜帶率無統(tǒng)計學差異。 6.雙重qPCR利用質粒標準品優(yōu)化的雙重熒光定量PCR體系來擴增一系列不含NDM和KPC基因的標準株,在NDM和KPC檢測通道均未見擴增曲線,證明其特異性好。兩種種質粒在108～101copies范圍內都有很好的線性關系,最低均能檢測到10個拷貝數(shù)的質粒。NDM和KPC重組質粒在105拷貝數(shù)的批內和批間變異系數(shù)均小于5%,說明本研究建立的雙重實時熒光定量PCR方法重復性和穩(wěn)定性好。對220株經普通PCR擴增和測序驗證標本采用已建立的雙重qPCR體系進行檢測,檢測結果與普通PCR結果完全符合。 結論 1.國際首次在霍氏腸桿菌中檢出NDM-1基因,并且該基因與基因盒排列為intI1+dfrA16+aadA2+qacdelsul+ISCR1+qnrA1+ampR+qacdelsul的復雜性I類整合子共存于同一接合性質粒上,這種共存模式也為首次報道。國際首次在肺炎克雷伯菌的一種新的序列型ST530中同時檢出KPC-2和IMP-4兩種碳青霉烯酶。 2.我院的腸桿菌科超級細菌主要是NDM-1型,其次是KPC-2型和IMP-4型。非發(fā)酵超級細菌中鮑曼不動桿菌主要產OXA類碳青霉烯酶,銅綠假單胞菌主要產IMP和VIM酶,與國內外研究一致。 3.腸桿菌科超級細菌和非發(fā)酵超級細菌中鮑曼不動桿菌Ⅰ類整合子、ISCR1的陽性率較高,銅綠假單胞菌中二者檢出率較低,但含有的基因盒類型多。所有超級細菌中共有兩種新型復雜性I類整合子結構檢出。 4.超級細菌對碳青霉烯耐藥的主要原因是產生碳青霉烯酶,尤以KPC型的和NDM型的酶耐藥譜更為廣泛,水解作用更強,整合子和ISCR等移動耐藥元件在耐藥基因的水平轉移方面有一定的作用,參與介導細菌對多種抗生素耐藥,特別是氨基糖苷類、喹諾酮類和β內酰胺類。但總的來說細菌耐藥機制是個復雜的過程,通常是多個機制共同作用的結果。 5.成功地建立了一種快速、敏感、特異的雙重熒光定量PCR方法,能在單一體系同時檢測兩個重要的碳青霉烯酶基因NMD和KPC。本方法有意識針對NMD和KPC兩基因保守區(qū)設計引物和探針能同時檢測出所有的已知亞型。 6.新的耐藥基因或耐藥形式的出現(xiàn)都是抗生素選擇壓力的結果，因此合適使用抗生素顯得至關重要。另外,目前產碳青霉烯酶菌株的快速出現(xiàn)和播散對全球公共衛(wèi)生事業(yè)造成嚴重威脅,應及時對常見碳青霉烯酶基因進行檢測和監(jiān)測,防止這種超級細菌蔓延和傳播。
【關鍵詞】：NDM KPC ISCR 整合子 MLST
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-28
• 第一部分 腸桿菌科超級細菌碳青霉烯酶基因和可移動耐藥元件結構研究28-50
• 1.1 材料28-30
• 1.2 方法30-39
• 1.3 結果39-45
• 1.4 討論45-50
• 第二部分 非發(fā)酵革蘭陰性超級細菌碳青霉烯酶基因和可移動耐藥元件結構研究50-64
• 2.1 材料50-51
• 2.2 方法51-53
• 2.3 結果53-60
• 2.4 討論60-64
• 第三部分 NDM和KPC雙重熒光定量PCR方法建立64-79
• 3.1 材料64-65
• 3.2 方法65-70
• 3.3 結果70-75
• 3.4 討論75-79
• 全文總結79-82
• 參考文獻82-88
• 第一作者完成和發(fā)表論文情況88-89
• 致謝89-91

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