本文關(guān)鍵詞：一個TetR家族轉(zhuǎn)錄因子Rv3066的調(diào)控功能分析及其對細(xì)菌耐藥性的影響

  更多相關(guān)文章： 結(jié)核分枝桿菌 Rv3066 藥物外排泵 耐藥性

【摘要】：結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,以下簡稱M. tuberculosis)是最具破壞性的人類病原菌之一,隨著耐多藥結(jié)核病(Multidrug-resistant tuberculosis,以下簡稱MDR-TB)的出現(xiàn)以及與HIV共感染在全世界范圍的廣泛流行,該病原菌對人類的健康產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅。因此,研究M. tuberculosis的耐藥性顯得尤為迫切。Mmr(由 rv3065所編碼)是M. tuberculosis中唯一一個屬于SMR家族的藥物外排泵,能識別并能有效排出大量抗菌劑,促使M. tuberculosis對這些抗菌劑產(chǎn)生內(nèi)在抗藥性。然而目前對Mmr的體內(nèi)調(diào)控機(jī)制還研究得不清楚。巧合的是,TetR家族轉(zhuǎn)錄因子Rv3066與mmr基因處于同一個操縱子,推測Rv3066可能調(diào)控mmr的表達(dá),進(jìn)而影響M. tuberculosis的耐藥性。因此本課題開展了Rv3066的功能分析及其對細(xì)菌耐藥性的研究,研究結(jié)果如下：(1)采用細(xì)菌單雜交實(shí)驗(yàn)和凝膠遷移率(EMSA)實(shí)驗(yàn)證明了轉(zhuǎn)錄因子Rv3066與mmrp存在相互作用；(2)利用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)證明了Rv3066與mmrp在體內(nèi)也存在相互作用；(3)通過EMSA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Rv3066與mmrp結(jié)合模體可能位于其S2小片段中,進(jìn)一步通過競爭實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)錄因子Rv3066與S2片段的結(jié)合是特異的；(4)采用DNA酶足跡法(I)NaseI footprinting),鑒定出了轉(zhuǎn)錄因子Rv3066與 mmrp的結(jié)合模體；(5)采用p-半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)和實(shí)時定量PCR (qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)證明了Rv3066為轉(zhuǎn)錄抑制子,抑制mmr基因的表達(dá)；(6)在Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin(以下簡稱M. bovis BCG)中將rv3066的同源基因bcg_3091敲除之后,該菌株生長速率變慢,對Mmr外排泵底物吖啶黃、溴化乙錠(以下簡稱EB)產(chǎn)生抗性。綜上所述,我們推測轉(zhuǎn)錄因子Rv3066為轉(zhuǎn)錄抑制子,在體內(nèi)通過影響mmr基因的表達(dá),進(jìn)而影響M. tuberculosis對藥物產(chǎn)生抗性。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 Rv3066 藥物外排泵 耐藥性
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 中文摘要6-7
• ABSTRACT7-9
• 縮略語表9-11
• 1 前言11-23
• 1.1 結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機(jī)制11-18
• 1.1.1 耐一線抗結(jié)核藥物的分子機(jī)制12-14
• 1.1.2 藥物外排泵14-18
• 1.2 藥物外排泵與基因調(diào)控18
• 1.3 Mmr外排泵研究現(xiàn)狀18-19
• 1.4 TetR家族轉(zhuǎn)錄因子概況19-20
• 1.5 轉(zhuǎn)錄因子Rv3066研究現(xiàn)狀20-21
• 1.6 課題研究的目的與意義21-22
• 1.7 課題研究主要內(nèi)容22-23
• 2 實(shí)驗(yàn)材料和方法23-39
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-27
• 2.1.1 培養(yǎng)基23
• 2.1.2 酶和抗生素23-24
• 2.1.3 菌株24-25
• 2.1.4 質(zhì)粒25-26
• 2.1.5 引物26-27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-39
• 2.2.1 分子生物學(xué)基本操作27
• 2.2.2 細(xì)菌單雜交27-28
• 2.2.3 M.bovis BCG感受態(tài)細(xì)胞的制備28
• 2.2.4 電轉(zhuǎn)化28-29
• 2.2.5 質(zhì)粒提取29
• 2.2.6 蛋白質(zhì)表達(dá)純化及透析29-30
• 2.2.7 抗血清制備30
• 2.2.8 凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)30-31
• 2.2.9 DNA酶足跡實(shí)驗(yàn)(DNaseI footprinting)31-32
• 2.2.10 敲除菌株的獲得32-33
• 2.2.11 Southern Blot33-35
• 2.2.12 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)35-36
• 2.2.13 實(shí)時定量PCR(qRT-PCR)36-38
• 2.2.14 β-半乳糖苷酶活性測定38
• 2.2.15 生長曲線測定38-39
• 3 結(jié)果與分析39-60
• 3.1 細(xì)菌單雜交實(shí)驗(yàn)證明Rv3066與mmrp存在潛在的物理相互作用39-42
• 3.1.1 rv3066基因片段及mmrp片段的獲得39-40
• 3.1.2 pBX-mmrp及pTRG-Rv3066質(zhì)粒的構(gòu)建40-41
• 3.1.3 細(xì)菌單雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)Rv3066與mmrp存在相互作用41-42
• 3.2 EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子Rv3066與mmrp存在相互作用42-44
• 3.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白質(zhì)表達(dá)純化42-44
• 3.2.2 EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子Rv3066與mmrp存在相互作用44
• 3.3 染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)Rv3066與mmrp在體內(nèi)也存在相互作用44-46
• 3.4 啟動子截短后EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步鎖定結(jié)合位點(diǎn)46-48
• 3.5 DNA酶足跡實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)合模體48-50
• 3.5.1 DNA酶足跡實(shí)驗(yàn)48-49
• 3.5.2 保守位點(diǎn)缺失后的EMSA實(shí)驗(yàn)49-50
• 3.6 pMind-BCG3091敲除載體的構(gòu)建及BCG/BCG3091::hyg菌株的獲得50-56
• 3.6.1 pMind-BCG3091敲除載體的構(gòu)建50-52
• 3.6.2 BCG/BCG3091：：hyg敲除菌株獲得52-54
• 3.6.3 Southern Blot證實(shí)bcg_3091已被成功敲除54-56
• 3.7 轉(zhuǎn)錄因子Rv3066為轉(zhuǎn)錄抑制子56-58
• 3.7.1 β-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)Rv3066對mmrp起阻遏調(diào)節(jié)作用56-57
• 3.7.2 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)Rv3066抑制mmr基因的表達(dá)57-58
• 3.8 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)證明Rv3066的調(diào)控與M.tuberculosis抗藥性有關(guān)58-60
• 4 總結(jié)與討論60-63
• 4.1 總結(jié)60
• 4.2 討論60-63
• 參考文獻(xiàn)63-73
• 致謝73

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