發(fā)布時(shí)間：2017-08-07 16:32

  本文關(guān)鍵詞：降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)ALI時(shí)小鼠巨噬細(xì)胞替代激活的影響

  更多相關(guān)文章： 急性肺損傷 降鈣素基因相關(guān)肽 替代激活 巨噬細(xì)胞

【摘要】：巨噬細(xì)胞為免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞,其在機(jī)體中執(zhí)行的功能由其特定的激活方式?jīng)Q定。巨噬細(xì)胞的激活大致分為兩種：經(jīng)典激活和替代激活。其中替代激活在炎癥反應(yīng)后期較為常見,發(fā)生替代激活的巨噬細(xì)胞通過分泌多種抗炎和促修復(fù)介質(zhì)參與炎癥消退與組織修復(fù)。體外IL-4可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞替代激活,精氨酸酶-1(arginase-1, Arg-1)和IL-10是巨噬細(xì)胞替代激活的標(biāo)志性蛋白。在多種肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展中均存在不同表型巨噬細(xì)胞激活的失衡。急性肺損傷(acute lung injury, ALI)時(shí),巨噬細(xì)胞替代激活可有效調(diào)控炎癥反應(yīng),加速ALI的損傷修復(fù)。因此,尋找促進(jìn)巨噬細(xì)胞替代激活的內(nèi)外源性物質(zhì),對(duì)ALI時(shí)的瀑布式炎癥反應(yīng)進(jìn)行及時(shí)、有效的干預(yù),對(duì)防治ALI的炎癥遷延、促進(jìn)損傷修復(fù)意義重要。 降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)是肺內(nèi)含量最為豐富的神經(jīng)肽。研究表明CGRP主要通過調(diào)控炎癥介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞趨化因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生,進(jìn)而發(fā)揮對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫功能的調(diào)節(jié)作用,但其對(duì)巨噬細(xì)胞替代激活的影響尚未見相關(guān)報(bào)道。本課題將從整體和細(xì)胞水平分別觀察小鼠ALI動(dòng)物模型和LPS應(yīng)激的小鼠巨噬細(xì)胞CGRP的表達(dá)變化,并研究CGRP對(duì)IL-4誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞替代激活的影響及其可能機(jī)制。 目的： 觀察ALI時(shí)小鼠肺組織內(nèi)CGRP mRNA表達(dá)的變化,探討CGRP對(duì)IL-4誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞替代激活的影響及其可能機(jī)制。 方法： 1.動(dòng)物模型復(fù)制：腹腔注射LPS復(fù)制小鼠ALI動(dòng)物模型,采用RT-PCR法分別檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肺內(nèi)CGRP mRNA的相對(duì)表達(dá)量。 2.細(xì)胞模型復(fù)制和時(shí)效量效檢測(cè)：IL-4處理小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7, ATCC:TIB-7TM)復(fù)制小鼠巨噬細(xì)胞替代激活模型,觀察CGRP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞替代激活的影響。采用RT-PCR法檢測(cè)各組Arg-1及IL-10mRNA的相對(duì)表達(dá)。Arg-1相對(duì)表達(dá)的時(shí)效檢測(cè)：時(shí)間點(diǎn)選取IL-4處理后的0h、8h、16h和24h,CGRP濃度為10-7M,預(yù)處理時(shí)間為1h; Arg-1相對(duì)表達(dá)的量效檢測(cè)：IL-4處理時(shí)間為24h, CGRP濃度為10-8、5×10-8、10-7和5×10-7M,預(yù)處理時(shí)間為1h。 3.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制：采用鈣調(diào)蛋白信號(hào)通路阻斷劑(W7)、PKC信號(hào)通路阻斷劑(H7)、和PKA信號(hào)通路阻斷劑(H89)預(yù)處理,觀察CGRP促進(jìn)IL-4誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞Arg-1mRNA表達(dá)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 結(jié)果： 1.ALI小鼠肺內(nèi)CGRPmRNA的表達(dá)RT-PCR檢測(cè)ALI小鼠0h、8h、16h、24h肺內(nèi)CGRP mRNA水平的相對(duì)表達(dá)。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,ALI小鼠肺內(nèi)CGRP的表達(dá)明顯增高(P0.05)；8h即達(dá)峰值,16h和24h較8h時(shí)表達(dá)略微降低。 2.LPS應(yīng)激下小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)CGRP mRNA的表達(dá) LPS處理小鼠巨噬細(xì)胞,8h后RT-PCR檢測(cè)其CGRP mRNA的表達(dá),與對(duì)照組相比,LPS處理明顯增加CGRP mRNA的表達(dá)量(P0.05)。 3. CGRP對(duì)IL-4誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞替代激活標(biāo)志分子Arg-1和IL-10mRNA表達(dá)的影響 (1) Arg-1:RT-PCR結(jié)果顯示,CGRP預(yù)處理對(duì)靜息狀態(tài)小鼠巨噬細(xì)胞Arg-1mRNA的表達(dá)無影響(P0.05),但可呈時(shí)間依賴性(0、8、16、24h)和濃度依賴性(10-8、5×10-8、10-7、5×10-7M)促進(jìn)IL-4誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞替代激活時(shí)Arg-1mRNA的表達(dá)(P0.05)。 (2) IL-10:RT-PCR結(jié)果顯示,靜息狀態(tài)小鼠巨噬細(xì)胞IL-10mRNA表達(dá)水平較低,CGRP預(yù)處理可促進(jìn)IL-4誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞IL-10mRNA的表達(dá)(P0.05)。 4. CGRP促進(jìn)IL-4誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞Arg-1mRNA表達(dá)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,IL-4可促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞Arg-1mRNA的表達(dá),CGRP可進(jìn)一步增加其表達(dá)(P0.05)；而鈣調(diào)蛋白信號(hào)通路阻斷劑(W7)、PKC信號(hào)通路阻斷劑(H7)和PKA信號(hào)通路阻斷劑(H89)預(yù)處理均可抑制CGRP對(duì)IL-4的促進(jìn)效應(yīng)(P0.05)。 結(jié)論： 1.LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺內(nèi)CGRP mRNA表達(dá)增加。 2. CGRP可促進(jìn)IL-4誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞替代激活,其胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制可能與鈣調(diào)蛋白、PKC和PKA信號(hào)通路有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：急性肺損傷 降鈣素基因相關(guān)肽 替代激活 巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-14
• 1 前言14-16
• 2 材料與方法16-25
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-17
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16
• 2.1.2 細(xì)胞16
• 2.1.3 試劑16-17
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法17-25
• 2.2.1 常用溶液及緩沖液配制17-18
• 2.2.2 小鼠ALI動(dòng)物模型的復(fù)制18
• 2.2.3 肺組織HE染色18
• 2.2.4 肺組織總RNA的提取18-19
• 2.2.5 小鼠巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)19
• 2.2.6 培養(yǎng)前器具處理19-20
• 2.2.7 細(xì)胞復(fù)蘇20
• 2.2.8 細(xì)胞狀態(tài)觀察及活力檢測(cè)20
• 2.2.9 細(xì)胞換液和傳代20-21
• 2.2.10 細(xì)胞凍存21
• 2.2.11 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組21
• 2.2.12 巨噬細(xì)胞替代激活模型的復(fù)制21
• 2.2.13 細(xì)胞總RNA提取21-22
• 2.2.14 逆轉(zhuǎn)錄22-23
• 2.2.15 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)23-24
• 2.2.16 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析24-25
• 3 結(jié)果25-32
• 3.1 ALI時(shí)小鼠肺內(nèi)CGRP mRNA表達(dá)的變化25-26
• 3.1.1 小鼠ALI動(dòng)物模型的驗(yàn)證25
• 3.1.2 ALI小鼠肺組織CGRP mRNA表達(dá)的變化25-26
• 3.2 LPS應(yīng)激小鼠巨噬細(xì)胞CGRP mRNA表達(dá)的變化26-28
• 3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及活力檢測(cè)26-27
• 3.2.2 總RNA提取結(jié)果27
• 3.2.3 LPS應(yīng)激下小鼠巨噬細(xì)胞CGRP mRNA表達(dá)的變化27-28
• 3.3 CGRP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞替代激活的影響及機(jī)制28-32
• 3.3.1 CGRP對(duì)靜息狀態(tài)小鼠巨噬細(xì)胞Arg-1 mRNA表達(dá)的影響28
• 3.3.2 CGRP對(duì)IL-4誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞Arg-1 mRNA表達(dá)的影響28-30
• 3.3.3 CGRP對(duì)IL-4誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞IL-10 mRNA表達(dá)的影響30
• 3.3.4 CGRP上調(diào)IL-4誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞Arg-1 mRNA表達(dá)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制30-32
• 4 討論32-36
• 5 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-43
• 綜述43-63
• 參考文獻(xiàn)55-63
• 攻讀學(xué)位期間主要的研究成果63-64
• 致謝64

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：635656