本文關(guān)鍵詞：新型雙功能糖苷酶的表達(dá)純化及功能研究

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【摘要】：目的：抗體的糖型對抗體的功能有著極其重要的影響，PNGase F和Endo F2是糖苷酶家族中的重要成員，在抗體和抗體糖型的鑒定中發(fā)揮著重要作用，但這兩種酶的酶切最適pH值差異巨大，無法在同一pH的緩沖液下進行抗體單步酶切，并且PNGase F無法切除位于抗體Fab段的糖鏈。若抗體在多個部分有糖基化修飾，那么就要兩種酶進行多步酶切，而這會對后期抗體及其糖型的檢測造成不可控的影響，如何在同一pH下使兩種酶均能發(fā)揮作用目前尚未有研究。 方法：分別通過全基因合成得到PNGase F及Endo F2基因片段，采用大腸桿菌進行表達(dá)，純化過后得到了PNGase F及Endo F2，然后通過晶體模擬及蛋白參數(shù)的運算，決定采用融合蛋白的方式來完成Endo F2的pH shift，確定了通過串聯(lián)兩段基因進行表達(dá)的可行性，將Endo F2及PNGase F基因串聯(lián)片段克隆到pET32a+載體上，并誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)獲得大量重組可溶性的糖苷酶，進而采用兩步純化，得到具有活性的高純度“融合酶”。采用該酶進行抗體酶切，并通過質(zhì)譜及SDS-PAGE來進一步確定“融合酶”pH shift的有效性。 結(jié)果：通過串聯(lián)表達(dá)構(gòu)建的“融合酶”不但實現(xiàn)了可溶性表達(dá)，可以應(yīng)用于寬泛的pH范圍，，可在同一pH緩沖液中同時發(fā)揮兩種酶的作用，并且可以在非變性的條件下有效地切除抗體中FC及Fba上的糖鏈，具有很好的脫糖基的作用。 結(jié)論： Endo F2和PNGase F融合表達(dá)后，形成了一種新型雙功能酶，成功地實現(xiàn)了pH shift。該“融合酶”可在同一pH下良好的發(fā)揮相應(yīng)作用。很好的解決了當(dāng)抗體中有多個糖基化位點時的酶切鑒定問題。
【關(guān)鍵詞】：Endo F2 PNGase F 融合酶 pH shift 脫糖作用
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-8
• 引言8-10
• 第一部分 重組 Endo F2 和 PNGase F 蛋白的表達(dá)和純化10-30
• 1. 材料與方法11-22
• 2. 實驗結(jié)果22-27
• 3. 討論27-30
• 第二部分 融合串聯(lián) Endo F2-PNGase F 蛋白的表達(dá)和純化30-46
• 1 材料與方法30-39
• 2 實驗結(jié)果39-44
• 3 討論44-46
• 第三部分 融合蛋白 Endo F2-PNGase F 的功能檢測46-55
• 1 材料與方法46-50
• 2 結(jié)果50-53
• 3 討論53-55
• 結(jié)論55-56
• 參考文獻56-59
• 綜述59-69
• 參考文獻65-69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文69-70
• 縮略詞表70-71
• 致謝71-72

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 高曉蓉;王國坤;王嚴(yán);夏秀英;安利佳;;一種新的耐熱性植酸酶基因在煙草中的表達(dá)[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年34期

2 張文薈;沈微;饒志明;諸葛斌;方慧英;諸葛健;;來源于Thermomyces sp.的植酸酶基因在畢赤酵母中的組成型表達(dá)[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年22期

3 武燕平;楊平平;;真菌植酸酶的研究現(xiàn)狀和前景[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年24期

4 趙鄢鵬;李杰;劉琦;夏善勇;吳立成;王秀君;李希臣;;基于phy基因的雙邊界植物表達(dá)載體構(gòu)建[J];大豆科學(xué);2010年03期

5 劉琦;夏善勇;張軍;段忠衛(wèi);劉鑫磊;李希臣;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)植酸酶基因轉(zhuǎn)化大豆的研究[J];大豆科學(xué);2011年03期

6 謝英利;楊海龍;吳明江;;植酸酶發(fā)酵生產(chǎn)的研究進展[J];飼料工業(yè);2011年02期

7 覃擁靈;何海燕;;米曲霉A-1固體發(fā)酵產(chǎn)胞外高活性植酸酶工藝研究[J];飼料工業(yè);2011年24期

8 覃擁靈;何海燕;;產(chǎn)植酸酶菌種的選育及發(fā)酵條件初步研究[J];廣西輕工業(yè);2011年08期

9 何海燕;張健;覃擁靈;;米曲霉A-1植酸酶快速純化及酶學(xué)性質(zhì)[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年01期

10 魏香;王曉云;周波;周海夢;;Effect of Urea on Activity and Conformation of a Glycoprotein[J];Tsinghua Science and Technology;2006年04期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 岳暉;DsbC對植酸酶體外折疊及功能影響的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 仲偉磊;引入新的二硫鍵對植酸酶結(jié)構(gòu)和功能的影響[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

3 劉開泉;利用原核系統(tǒng)表達(dá)富含二硫鍵蛋白質(zhì)的探索與改進[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

4 魏威;植酸酶基因突變表達(dá)及突變蛋白熱穩(wěn)定性的研究[D];暨南大學(xué);2004年

5 宋耿云;植酸酶構(gòu)象穩(wěn)定性與催化活性的關(guān)系及抑制動力學(xué)研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

6 李躍;植酸酶在不同植酸磷水平肉雞飼糧中的應(yīng)用效果研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

7 王國坤;泡盛曲霉植酸酶基因轉(zhuǎn)化煙草的研究[D];大連理工大學(xué);2006年

8 蔣利平;曲霉phyA基因的克隆及在Pichia pastoris中的分泌表達(dá)[D];山東大學(xué);2007年

9 趙冬敏;植酸酶基因phyA的克隆及在畢赤酵母中的高效表達(dá)[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

10 穆熙軍;利用定點突變技術(shù)對植酸酶中二硫鍵功能的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

本文編號：630520