本文關鍵詞：高滲敏感煙曲霉T-DNA插入突變體的篩選和相關基因與致病力的關系研究

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【摘要】：煙曲霉（Aspergillus fumigatus）是自然環(huán)境中廣泛存在的腐生真菌，分生孢子體積較�。ㄖ睆綖�2～3μm），可以經空氣播散且存活時間較長。人體每天吸入幾百個煙曲霉分生孢子，這些孢子可以經鼻腔、氣管到達支氣管末端和肺泡。 機體免疫功能健全的情況下，非特異性和特異性免疫應答可以有效清除這些孢子。然而，近些年隨著臨床上骨髓移植、器官移植以及化學藥物治療的開展，白血病、囊泡性纖維化、感染HIV等患者的增加，類固醇類激素、糖皮質激素和免疫抑制劑的使用導致機體免疫功能受損，防御能力降低，無法抵御煙曲霉分生孢子的黏附和侵襲，致使煙曲霉引起的感染病死率一直在50%以上。 1、利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系獲得煙曲霉T-DNA插入突變體 根癌農桿菌攜帶有一個腫瘤誘導質粒（tumor-inducing plamid，Ti質粒）。根癌農桿菌侵染植物細胞時，Ti質粒的基因片段即T-DNA（transfer DNA）能夠隨機整合到宿主染色體，導致細胞生長調控失衡，形成冠癭瘤。質粒上的毒力基因在侵染過程中編碼毒力蛋白，負責單鏈T-DNA的形成、轉移和隨機插入基因組。利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系（Agrobacterium tumefaciens-mediatedT-DNA insertional mutagenesis，ATMT）獲得3205株煙曲霉T-DNA插入突變體（Aspergillus fumigatus insertion mutants，，AFM），每一個突變體都相當于一個基因敲除株，T-DNA插入突變缺失位點多為單拷貝，HI-TAILPCR和BLAST方法可以定位插入位點相關基因，從而為研究基因功能提供菌株資源。 2、篩選高滲敏感煙曲霉T-DNA插入突變體 利用由無機鹽離子NaCl構成高滲透壓力，平板法篩選在1.25M NaCl濃度下較野生型菌落直徑減小、分生孢子生成障礙等表型發(fā)生改變的T-DNA插入突變體，總共從2086株中篩選出320株，建立高滲敏感煙曲霉T-DNA插入突變體亞庫。其中108株突變體通過HI-TAIL-PCR和BLAST確定插入突變基因，分析結果這些基因滲透壓感受、膜通道、能量代謝和細胞周期等相關。 3、構建煙曲霉金屬平衡蛋白bsd2基因敲除株和回復突變株 AFM3217在1.25M NaCl濃度下表現為菌落直徑減小、白化，分生孢子生成減少。HI-TAIL-PCR和BLAST比對確定打斷的序列位于bsd2基因上游啟動子區(qū)域的TATA盒，阻礙了轉錄因子與啟動子區(qū)域的結合，導致bsd2基因不能表達。bsd2基因敲除株與AFM3217表型基本一致，回復突變株與野生型表型基本一致。 4、致病力和藥物敏感性實驗 煙曲霉秀麗隱桿線蟲感染模型顯示與野生型相比，AFM3217的致病力明顯下降。采用美國國家臨床試驗室標準化委員會（CLSI，原NCCLs）頒布的微量稀釋法方案（M38-A2），結果顯示AFM3217對氟康唑（fluconazole，FCZ）、伊曲康唑（itraconazole，ITC）、伏立康唑（voriconazole，VCZ）、泊沙康唑（posaconazole，POS）、兩性霉素B（amphotericin B，AMB）、卡泊芬凈（caspofungin，CAS）、特比萘芬（terbinafine，TRB）和匹馬毒素（pimagedine，PIM）的敏感性與野生型無明顯差異。
【關鍵詞】：煙曲霉 高滲脅迫 T-DNA 致病力
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R379
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 第1章 緒論13-21
• 1.1 煙曲霉和煙曲霉感染13-14
• 1.1.1 煙曲霉的分類學地位和生物學特性13-14
• 1.1.2 煙曲霉引起的機體感染14
• 1.2 煙曲霉致病因子和致病機制的研究現狀14-16
• 1.2.1 煙曲霉致病因子的研究現狀15-16
• 1.2.2 煙曲霉致病機制的研究進展16
• 1.3 滲透壓應激在煙曲霉感染中的作用機制16-20
• 1.3.1 煙曲霉感染機體時面臨的應激反應16-17
• 1.3.2 高滲透壓應激的研究進展17-20
• 1.4 本研究的目的和意義20-21
• 第2章 利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系（ATMT）獲得煙曲霉T-DNA 插入突變體21-27
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 菌株21
• 2.1.2 培養(yǎng)基21-22
• 2.1.3 試劑22-23
• 2.1.4 儀器設備23
• 2.2 方法23-25
• 2.2.1 煙曲霉 IFM40808 分生孢子懸濁液的制備23-24
• 2.2.2 根癌農桿菌 AGL-1 的活化和誘導培養(yǎng)24
• 2.2.3 煙曲霉 IFM40808 與根癌農桿菌 AGL-1 共培養(yǎng)24
• 2.2.4 轉化獲得煙曲霉 T-DNA 插入突變體24-25
• 2.3 結果25
• 2.4 討論25-27
• 第3章 建立高滲敏感煙曲霉 T-DNA 插入突變體亞庫27-30
• 3.1 材料27-28
• 3.1.1 菌株27
• 3.1.2 試劑27
• 3.1.3 儀器設備27-28
• 3.2 方法28
• 3.2.1 煙曲霉 IFM40808 在不同 NaCl 濃度構成的高滲透壓條件下的生長狀態(tài)28
• 3.2.2 高滲透壓培養(yǎng)基篩選敏感煙曲霉 T-DNA 插入突變體28
• 3.2.3 高滲敏感煙曲霉 T-DNA 插入突變體的形態(tài)學觀察28
• 3.3 結果28-29
• 3.4 討論29-30
• 第4章 高滲敏感煙曲霉 T-DNA 插入突變體的分子分析30-42
• 4.1 材料30-31
• 4.1.1 菌株30
• 4.1.2 試劑30
• 4.1.3 儀器設備30-31
• 4.2 方法31-35
• 4.2.1 高滲透壓敏感煙曲霉 T-DNA 插入突變體基因組 DNA 的提取31-32
• 4.2.2 HI-TAIL PCR 擴增煙曲霉 T-DNA 突變體的側翼序列32-35
• 4.2.3 HI-TAIL-PCR 產物測序35
• 4.3 結果35-39
• 4.3.1 煙曲霉 T-DNA 插入突變體 PCR 檢測 hph35-36
• 4.3.2 HI-TAIL PCR 擴增 T-DNA 插入突變體側翼序列36
• 4.3.3 高滲敏感煙曲霉 T-DNA 插入突變體36-38
• 4.3.4 功能基因分析38-39
• 4.4 討論39-42
• 第5章 構建煙曲霉 BSD2 基因敲除株和回復突變株42-61
• 5.1 材料42
• 5.1.1 菌株42
• 5.1.2 試劑42
• 5.1.3 培養(yǎng)基42
• 5.1.4 儀器設備42
• 5.2 生物信息學分析 AFM3217 的插入突變位點42-43
• 5.3 RT- PCR 驗證 BSD2 的轉錄水平43-45
• 5.3.1 設計特異性引物43
• 5.3.2 提取 IFM40808 和 AFM3217 的總 RNA43-44
• 5.3.3 逆轉錄反應合成 cDNA44-45
• 5.3.4 RT-PCR 反應45
• 5.4 構建 BSD2 的基因缺失株和回復突變株45-57
• 5.4.1 構建 bsd2 基因敲除株45-52
• 5.4.2 構建 bsd2 基因回復突變株52-57
• 5.5 野生型，AFM3217，BSD2 基因敲除株和回復突變株生物學性狀比較57
• 5.6 結果57-60
• 5.7 討論60-61
• 第6章 煙曲霉秀麗隱桿線蟲感染實驗和藥物敏感性實驗61-65
• 6.1 材料61-62
• 6.1.1 菌株61
• 6.1.2 培養(yǎng)基61-62
• 6.2 儀器設備62
• 6.3 方法62
• 6.3.1 大腸桿菌 OP50 菌液的制備：62
• 6.3.2 秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)：62
• 6.4 煙曲霉秀麗隱桿線蟲感染模型的建立62
• 6.5 藥物敏感性實驗62-63
• 6.5.1 菌懸液制備62
• 6.5.2 微量稀釋法檢測待測 IFM40808 和 AFM3217 對抗真菌藥物的敏感性62-63
• 6.6 結果63-64
• 6.6.1 秀麗隱桿線蟲致病模型63
• 6.6.2 最低抑菌濃度（MIC）的判定63-64
• 6.7 討論64-65
• 第7章 結論65-66
• 參考文獻66-78
• 在學期間取得的科研成果78-79
• 致謝79

【共引文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 程娜;曉軍;趙民安;張文明;姚大年;;農桿菌介導遺傳轉化宿主的研究進展[J];安徽農業(yè)科學;2006年24期

2 陳東亮;李紀元;范正琪;范妙華;;根癌農桿菌介導真菌遺傳轉化的影響因素及應用[J];安徽農業(yè)科學;2010年07期

3 胡凱;王微;;紫杉二烯合成酶基因轉化紅豆杉內生真菌XT5的研究[J];安徽農業(yè)科學;2011年02期

4 陳鳳;王坤;銀超;李德明;任楠;李俊星;;根癌農桿菌介導的泡盛曲霉遺傳轉化系統(tǒng)的構建[J];安徽農業(yè)科學;2012年16期

5 楊豐科;姜萍;李思東;王守滿;;絲狀真菌基因工程進展[J];氨基酸和生物資源;2009年01期

6 喬建軍;劉偉;馬彥;萬U

本文編號：620486