本文關(guān)鍵詞：人類博卡病毒-1型啟動(dòng)子分析及非結(jié)構(gòu)蛋白NS1反式作用的研究

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【摘要】：人類博卡病毒-1(Human bocavirus1, HBoV1)歸類于細(xì)小病毒科,細(xì)小病毒亞科,博卡病毒屬。基因組全長約5.5kb,含左端唯一啟動(dòng)子,編碼兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1(nonstructural protein)和NP1(nuclear phosphoprotein),兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白VP1(vira1structural protein1)與VP2(viral structural protein2)。NP1是博卡病毒的特有蛋白,對其研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展,如存在一個(gè)非典型的核定位信號(hào),調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等等。但作為在病毒感染細(xì)胞后最先被轉(zhuǎn)錄和翻譯且對其基因組復(fù)制必須的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1,卻研究甚少。 本課題對我們前期研究中分離到的武漢HBoV1病毒株(pWHL-1NCBI GeneB ank:GU139423)的啟動(dòng)子及NS1進(jìn)行了初步研究。將全長252nt的啟動(dòng)子截短突變,運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測各截短突變的表達(dá)活性。結(jié)果顯示,在96-145nt內(nèi)有一些可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),對啟動(dòng)子的活性有重要的影響,而146-196nt為啟動(dòng)子的核心區(qū)域。對96-145nt內(nèi)的部分核心元件進(jìn)行點(diǎn)突變后,發(fā)現(xiàn)CAAT-box的突變會(huì)導(dǎo)致啟動(dòng)子的活性顯著降低,而TATA-box及CREB、CdxA兩個(gè)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的突變對其活性卻無顯著影響。同樣運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)探究了HBoV1的NS1對自身啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-κB、STAT3和GAS啟動(dòng)子的正調(diào)控活性,發(fā)現(xiàn)NS1的274-379aa為反式作用的關(guān)鍵性區(qū)域,AP-1、NF-κB、STAT3啟動(dòng)子受NS1的調(diào)控,對GAS啟動(dòng)子活性并無顯著影響。并將NS1基因全長及截短克隆到pEGFP-N1載體中,研究其在細(xì)胞內(nèi)的定位,證實(shí)在180-274aa內(nèi)有入核信號(hào)(NuclearImport Signal, NLS),340-562aa內(nèi)有核輸出信號(hào)(Nuclear Export Signal, NES)。 HBoV1啟動(dòng)子的分析、NS1對自身啟動(dòng)子正調(diào)控活性及NS1在細(xì)胞內(nèi)定位的研究結(jié)果,為病毒蛋白的表達(dá)及其復(fù)制機(jī)制提供了參考數(shù)據(jù)；并首次發(fā)現(xiàn)NS1對NF-κB、AP-1、STAT3這幾種涉及炎癥反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子具有正調(diào)控作用,揭示了NS1可能與HBoVl的致病性有關(guān),為進(jìn)一步研究HBoV1致病的分子機(jī)制提供了參考。
【關(guān)鍵詞】：HBoV1 啟動(dòng)子 NS1 反式作用 正調(diào)控 細(xì)胞內(nèi)定位
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 第一章 前言11-19
• 1.1 病毒結(jié)構(gòu)11-13
• 1.2 流行病學(xué)13
• 1.3 混合感染13-14
• 1.4 傳播14
• 1.5 感染靶標(biāo)器官和發(fā)病機(jī)理14-15
• 1.6 持續(xù)感染15
• 1.7 診斷15-16
• 1.8 風(fēng)險(xiǎn)因素16
• 1.9 治療16-17
• 1.10 小結(jié)17
• 1.11 PEGFP真核表達(dá)系統(tǒng)17-18
• 1.12 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)18-19
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料19-23
• 2.1 載體、菌株與細(xì)胞系19
• 2.2 試劑19
• 2.3 實(shí)驗(yàn)所需各種抗生素19-20
• 2.4 實(shí)驗(yàn)用各種溶液20-21
• 2.4.1 LB液體培養(yǎng)基20
• 2.4.2 LB固體平板及抗性篩選平板制備20-21
• 2.4.3 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基配制21
• 2.4.4 PBS緩沖液配制21
• 2.4.5 胰蛋白酶溶液配制21
• 2.5 引物設(shè)計(jì)21-23
• 2.5.1 HBoV突變引物設(shè)計(jì)21-22
• 2.5.2 NS1截短引物設(shè)計(jì)22-23
• 第三章 實(shí)驗(yàn)方法23-27
• 3.1 HBoV1啟動(dòng)子及各截短突變表達(dá)活性的檢測23
• 3.2 檢測HBoV1啟動(dòng)子在其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中的活性23
• 3.3 HBoV1啟動(dòng)子全長及各截短突變的活性檢測23-24
• 3.4 HBoV1啟動(dòng)子各點(diǎn)突變的的克隆及活性檢測24-25
• 3.5 NS1對HBoV1啟動(dòng)子的調(diào)控作用25-26
• 3.6 NS1的亞細(xì)胞定位26-27
• 第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-42
• 4.1 HBoV1啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的活性27-28
• 4.2 HBoV1啟動(dòng)子在293T細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)活性28-30
• 4.3 HBoV1啟動(dòng)子關(guān)鍵區(qū)域的鑒定分析30-34
• 4.5 NS1蛋白對HBoV1啟動(dòng)子的反式作用活性34-37
• 4.6 NS1對炎癥相關(guān)因子的調(diào)節(jié)37-39
• 4.7 NS1在細(xì)胞內(nèi)的定位39-42
• 第五章 結(jié)果討論42-44
• 參考文獻(xiàn)44-54
• 碩士期間發(fā)表論文54-55
• 致謝55

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 李京京;孫彬;歐陽錦鳳;陳瑩;韓虎;劉凱于;李毅;;人類博卡病毒HBoV1基因組克隆及啟動(dòng)子活性分析[J];生物工程學(xué)報(bào);2011年06期

2 孫彬;李永淑;董衍明;劉凱于;楊勇波;李毅;;人博卡病毒HBoV1非結(jié)構(gòu)蛋白NP1對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[J];微生物學(xué)報(bào);2013年07期

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本文編號(hào)：618256